本课题组以高集成度微流体芯片为核心，结合新型生化分析方法，研制用于癌症无创诊断，细菌感染多维度分析和环境病原菌监测的快速、高灵敏检验技术。
1. 肿瘤检测及癌症转移机制研究
通过对血液中的循环DNA(ctDNA)进行分析和检测，可以实现对肿瘤的早期诊断、突变基因分型和病程监控，指导个性化治疗方案和评估治疗效果，提高患者的生存率和生存质量。针对肿瘤转移机制的研究有助于深入理解肿瘤的发生、发展和转移过程，为肿瘤治疗提供更深入的理论基础和新的治疗靶点。
1.1 用于肿瘤液体活检的高密度数字PCR芯片
ctDNA在血液中的含量低(ng/mL)且野生型基因背景较高，给无创肺癌基因分型带来巨大的挑战。为提高ctDNA突变检测的灵敏度和特异性，提出嵌入式微腔室排布方式，设计出高密度微腔室(7,000/cm2)数字PCR芯片。进而将120,000个微腔室集成到一张芯片上，实现了对10-107拷贝/mL DNA分子的检测。基于该芯片，建立了单分子DNA检测技术，将突变基因和野生型基因分别包裹在不同微腔室中，排除野生型基因对突变基因扩增的干扰，将突变基因的检出限由常规方法的1%提高至0.01%。临床肺癌血液样品检测结果显示，研究的单分子突变基因分型方法对肺癌表皮生长因子受体突变L858R和耐药突变T790M的检测灵敏度达到了85.71%和100%，特异性达到了94.44%和86.96%。
1.2 可凝固液滴生成油及单细胞肿瘤转移蛋白酶活性检测
液滴微流控技术具有良好的灵活性和分析通量，在数字化核酸检测和高通量单细胞分析中有巨大的应用潜力。但是，液滴的融合和移动导致无法实时追踪单个液滴中的生化反应和单细胞动态。为解决液滴融合和移动的问题，提出油相固化的策略，研制了基于硅氢化反应的可凝固液滴生成油(授权发明专利CN108543504B和CN108545692B)。利用该油相生成了高密度静态液滴阵列(18,000/cm2)，PCR反应后有效液滴数目几乎达到100%，并实现了实时液滴数字PCR（下图a和b）。可凝固油能够兼顾液滴微流体的高通量、灵活性和微腔室的稳定性、可寻址性。
为了深刻理解单细胞水平MMP-9活性与肿瘤转移的关系，利用可凝固油生成包裹单个肿瘤细胞的静态液滴阵列，建立高通量单细胞动态酶活性分析方法，研究时间分辨的单细胞MMP-9活性(下图b)。该研究定量地揭示出肿瘤细胞群中MMP-9表达的异质性，发现了MMP-9的活性存在时序调节的特点，加深了对肿瘤转移机制的理解，为肿瘤转移研究提供了新的视角和新研究技术。
2. 无标记病原菌分离
快速病原菌检测面临的两大难题是复杂的病原菌分离和耗时的活细菌检测(培养法-24h)。膜过滤法是最常用的水样中病原菌无标记分离方法。由于膜的黏附，膜过滤法回收病原菌会造成一定的样品损失。同时，该方法无法去除样品中的固体颗粒，可能对后续检测带来不良影响。为降低膜过滤法的损失率，在膜过滤的基础上引入惰性微流通道，设计能够产生Dean涡流的微通道，使病原菌保持悬浮状态，减少细菌黏附，将膜过滤法的细菌回收率由60%提高至95%(下图a)。
为去除样品中的固体颗粒，研究了基于微流体的无滤膜、无标记病原菌分离原理。通过构建具有微结构的双层微通道流体力学模型，研究通道内颗粒分选机制，设计具有双层微结构的颗粒分选芯片，能够有效地分离5 µm以上的颗粒物(下图b)。通过建立一个涉及层流、物质运输和粒子追踪的数值模型，发现特定深宽比的直通道内存在鞘流界面变形的现象。鞘流界面变形引起不同尺寸的微粒在通道内定向迁移而聚集(下图c)。基于此，设计鞘流变形微流体芯片，实现直通道内无标记细菌分离。该方法不影响细菌活性，可直接衔接下游检测。
3. 环境病原菌快速检测
基于细菌培养的病原菌检测耗时24h，而快速病原菌检测方法，如PCR和免疫标记，无法区分活细菌和死细菌。因此，这些方法不能及时可靠地预警饮用水细菌污染风险，导致不必要的经济损失。为实现快速的活细菌检测，首先提出了微腔室阵列3D拓展策略，设计了纵向立体分布的微腔室阵列芯片，微腔室的密度由2D微阵列7,000/cm2提高到25,000/cm2。然后研究大肠杆菌（E. coli）特异性代谢酶葡糖醛酸酶的表达机制，并将代谢酶活性检测与微阵列芯片结合，研发了数字化活细菌定量技术。该技术实现了在3.5 h内对活E. coli的鉴定和定量，显著缩短了标准法E. coli检测的时间。对细菌活性状态的区分是核酸检测和抗体标记法不具有的能力。数字化活细菌定量技术不受水样浑浊度和环境温度影响，能够测试出不同pH水体中活细菌的数目，也能够评估不同剂量氯氨的消毒效果。
4. 细菌感染多维度分析
现阶段，临床微生物实验室普遍采用多个实验串联的方式依次检测尿路感染病原菌含量，鉴定病原菌种类和抗生素敏感性分析，整个过程耗时4-5天，并且操作复杂。该方法不能在患者第一次就诊时帮助医生制定个性化的抗生素治疗方案。因此，急需能够直接对样品中的病原菌实现多维度分析的检测技术，用于细菌感染的诊断，指导个性化的抗生素治疗，遏制细菌耐药性的进一步恶化。
4.1 新型病原菌特异性药敏分析标志物
用于抗生素敏感性分析(AST)的表型标志物，多数不具有病原菌特异性，利用这些标志物直接对样品中的病原菌进行AST，其结果易受共生菌或细菌浓度的影响，不能准确反应病原菌耐药性。研究并发现具有病原菌特异性的新型AST标志物对实现快速、准确的尿液病原菌检测具有重大意义。通过系统性地研究耐药型和敏感型细菌的特异性诱导酶活性对不同类型抗生素的响应规律，发现特异性诱导酶活性与抗生素敏感性之间存在关联。研究表明细菌的诱导酶活性能够对不同类型的抗生素产生响应，且响应时间短至25 min (下图a和b)。不同浓度细菌的AST结果显示，基于诱导酶活性的AST测试结果不受细菌浓度的影响(下图c)。这一特性对准确测定未知浓度样品的敏感性十分重要。这些结果表明病原菌特异性诱导酶活性可以作为AST标志物。这一发现为研发样品中病原菌直接AST技术提供了新思路，有助于实现快速、准确的病原菌AST。
4.2 现场细菌感染多维度分析
现有的AST技术操作复杂，无法进行现场即时检测或在基层医疗机构中使用。为实现现场AST，研究设计具有同步液体分配器和3D交错微腔室阵列的即用型AST芯片，使用者仅需将待测样品加入到芯片中即可启动AST测试。该芯片采用负压驱动，无需外部设备辅助进样，降低了AST对外部设备的依赖。AST所需试剂已预先加载到3D微腔室阵列中，芯片中的同步液体分配器和立体通道网络可保证进样过程中AST试剂无泄漏。通过将特异性诱导酶活性检测和3D微腔室阵列相结合，研制多合一病原菌多维度药敏分析方法，在4.5h 内同时实现病原菌鉴定，定量和抗生素敏感性分析(传统方法耗时~3天)。该方法仅用一种实验实现快速多维度的细菌感染检测，显著地简化AST流程，缩短尿路感染诊断的时间，同时也可降低尿路感染诊断的成本，为推广抗生循证疗法提供了技术保障。
科研项目：
1. 江苏省自然科学基金（青年项目）,SBK2024044550，基于即用型微流体芯片的尿路病原菌快速药敏分析，20万元，2024.09-2027.08；
2. 工业控制技术全国重点实验室（开放课题）, ICT2024B16，基于机器学习和微阵列芯片的多重病原菌数字化定量检测技术研究，7万元，2024.09-2026.09.
