SETDB1及其与ATF7IP的1：1配合物的酶活性表征。,Biochemistry

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SETDB1及其与ATF7IP的1：1配合物的酶活性表征。
Biochemistry ( IF 2.9 ) Pub Date : 2016-02-11 , DOI: 10.1021/acs.biochem.5b01202
Aravind Basavapathruni ₁ , Jodi Gureasko ₁ , Margaret Porter Scott ₁ , William Hermans ₂ , Adarsh Godbole ₃ , Peter A Leland ₃ , P Ann Boriack-Sjodin ₁ , Tim J Wigle ₁ , Robert A Copeland ₁ , Thomas V Riera ₁

Affiliation

蛋白质甲基转移酶（PMT）SETDB1是黑色素瘤和肺癌的强大候选癌基因。据报道，利用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，SETDB1使组蛋白3（H3K9）的赖氨酸9甲基化，并由伴侣蛋白ATF7IP调节。在这里，我们检查了ATF7IP对SETDB1的体外活性和底物特异性的贡献。共表达SETDB1和ATF7IP，并纯化1：1化学计量的复合物，以与单独的SETDB1酶进行比较。我们采用了基于放射闪光板和SAMDI质谱分析的方法来追踪组蛋白H3 15-mer肽的甲基化，其中赖氨酸9未被修饰，被单甲基化或被二甲基化。结果显示SETDB1和SETDB1：ATF7IP复合物可有效催化H3K9肽底物的单甲基化和二甲基化。二元复合物的活性比单独的SETDB1低4倍。这种差异是由于kcat值的减小，因为底物KM值在SETDB1和SETDB1：ATF7IP复合体之间是可比的。SETDB1的H3K9甲基化是以分布方式发生的，这也不受ATF7IP的存在的影响。这一发现很重要，因为H3K9可以被SETDB1以外的HMT甲基化，并且分布机制将允许H3K9上的多个HMT之间相互作用。我们的结果表明，ATF7IP不会直接调节SETDB1的催化活性，提示其他作用，例如影响细胞定位或介导与其他结合伴侣的相互作用。二元复合物的活性比单独的SETDB1低4倍。这种差异是由于kcat值的减小，因为底物KM值在SETDB1和SETDB1：ATF7IP复合体之间是可比的。SETDB1的H3K9甲基化是以分布方式发生的，这也不受ATF7IP的存在的影响。这一发现很重要，因为H3K9可以被SETDB1以外的HMT甲基化，并且分布机制将允许H3K9上的多个HMT之间相互作用。我们的结果表明，ATF7IP不会直接调节SETDB1的催化活性，提示其他作用，例如影响细胞定位或介导与其他结合伴侣的相互作用。二元复合物的活性比单独的SETDB1低4倍。这种差异是由于kcat值的减小，因为底物KM值在SETDB1和SETDB1：ATF7IP复合体之间是可比的。SETDB1的H3K9甲基化是以分布方式发生的，这也不受ATF7IP的存在的影响。这一发现很重要，因为H3K9可以被SETDB1以外的HMT甲基化，并且分布机制将允许H3K9上的多个HMT之间相互作用。我们的结果表明，ATF7IP不会直接调节SETDB1的催化活性，提示其他作用，例如影响细胞定位或介导与其他结合伴侣的相互作用。这种差异是由于kcat值的减小，因为底物KM值在SETDB1和SETDB1：ATF7IP复合体之间是可比的。SETDB1的H3K9甲基化是以分布方式发生的，这也不受ATF7IP的存在的影响。这一发现很重要，因为H3K9可以被SETDB1以外的HMT甲基化，并且分布机制将允许H3K9上的多个HMT之间相互作用。我们的结果表明，ATF7IP不会直接调节SETDB1的催化活性，提示其他作用，例如影响细胞定位或介导与其他结合伴侣的相互作用。这种差异是由于kcat值的减小，因为底物KM值在SETDB1和SETDB1：ATF7IP复合体之间是可比的。SETDB1的H3K9甲基化是以分布方式发生的，这也不受ATF7IP的存在的影响。这一发现很重要，因为H3K9可以被SETDB1以外的HMT甲基化，并且分布机制将允许H3K9上的多个HMT之间相互作用。我们的结果表明，ATF7IP不会直接调节SETDB1的催化活性，提示其他作用，例如影响细胞定位或介导与其他结合伴侣的相互作用。这一发现很重要，因为H3K9可以被SETDB1以外的HMT甲基化，并且分布机制将允许H3K9上的多个HMT之间相互作用。我们的结果表明，ATF7IP不会直接调节SETDB1的催化活性，提示其他作用，例如影响细胞定位或介导与其他结合伴侣的相互作用。这一发现很重要，因为H3K9可以被SETDB1以外的HMT甲基化，并且分布机制将允许H3K9上的多个HMT之间相互作用。我们的结果表明，ATF7IP不会直接调节SETDB1的催化活性，提示其他作用，例如影响细胞定位或介导与其他结合伴侣的相互作用。

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Characterization of the Enzymatic Activity of SETDB1 and Its 1:1 Complex with ATF7IP.

The protein methyltransferase (PMT) SETDB1 is a strong candidate oncogene in melanoma and lung carcinomas. SETDB1 methylates lysine 9 of histone 3 (H3K9), utilizing S-adenosylmethionine (SAM) as the methyl donor and its catalytic activity, has been reported to be regulated by a partner protein ATF7IP. Here, we examine the contribution of ATF7IP to the in vitro activity and substrate specificity of SETDB1. SETDB1 and ATF7IP were co-expressed and 1:1 stoichiometric complexes were purified for comparison against SETDB1 enzyme alone. We employed both radiometric flashplate-based and SAMDI mass spectrometry assays to follow methylation on histone H3 15-mer peptides, where lysine 9 was either unmodified, monomethylated, or dimethylated. Results show that SETDB1 and the SETDB1:ATF7IP complex efficiently catalyze both monomethylation and dimethylation of H3K9 peptide substrates. The activity of the binary complex was 4-fold lower than SETDB1 alone. This difference was due to a decrease in the value of kcat as the substrate KM values were comparable between SETDB1 and the SETDB1:ATF7IP complex. H3K9 methylation by SETDB1 occurred in a distributive manner, and this too was unaffected by the presence of ATF7IP. This finding is important as H3K9 can be methylated by HMTs other than SETDB1 and a distributive mechanism would allow for interplay between multiple HMTs on H3K9. Our results indicate that ATF7IP does not directly modulate SETDB1 catalytic activity, suggesting alternate roles, such as affecting cellular localization or mediating interaction with additional binding partners.

更新日期：2016-02-11

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