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A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.
Nature Communications ( IF 14.7 ) Pub Date : 2015-Dec-17 , DOI: 10.1038/ncomms10237
Daniel H Lackner 1 , Alexia Carré 1 , Paloma M Guzzardo 1 , Carina Banning 1 , Ramu Mangena 2 , Tom Henley 2 , Sarah Oberndorfer 1 , Bianca V Gapp 3 , Sebastian M B Nijman 3 , Thijn R Brummelkamp 4 , Tilmann Bürckstümmer 1
Nature Communications ( IF 14.7 ) Pub Date : 2015-Dec-17 , DOI: 10.1038/ncomms10237
Daniel H Lackner 1 , Alexia Carré 1 , Paloma M Guzzardo 1 , Carina Banning 1 , Ramu Mangena 2 , Tom Henley 2 , Sarah Oberndorfer 1 , Bianca V Gapp 3 , Sebastian M B Nijman 3 , Thijn R Brummelkamp 4 , Tilmann Bürckstümmer 1
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Genome engineering has been greatly enhanced by the availability of Cas9 endonuclease that can be targeted to almost any genomic locus using so called guide RNAs (gRNAs). However, the introduction of foreign DNA sequences to tag an endogenous gene is still cumbersome as it requires the synthesis or cloning of homology templates. Here we present a strategy that enables the tagging of endogenous loci using one generic donor plasmid. It contains the tag of interest flanked by two gRNA recognition sites that allow excision of the tag from the plasmid. Co-transfection of cells with Cas9, a gRNA specifying the genomic locus of interest, the donor plasmid and a cassette-specific gRNA triggers the insertion of the tag by a homology-independent mechanism. The strategy is efficient and delivers clones that display a predictable integration pattern. As showcases we generated NanoLuc luciferase- and TurboGFP-tagged reporter cell lines.
中文翻译：
CRISPR-Cas9 介导的基因标记的通用策略。
Cas9 核酸内切酶的可用性大大增强了基因组工程，该酶可以使用所谓的引导 RNA (gRNA) 靶向几乎任何基因组位点。然而，引入外源DNA序列来标记内源基因仍然很麻烦，因为它需要合成或克隆同源模板。在这里，我们提出了一种策略，可以使用一个通用供体质粒来标记内源基因座。它包含感兴趣的标签，两侧是两个 gRNA 识别位点，允许从质粒中切除标签。用 Cas9、指定感兴趣基因组位点的 gRNA、供体质粒和盒特异性 gRNA 共转染细胞，通过同源独立机制触发标签的插入。该策略非常有效，并提供显示可预测集成模式的克隆。作为展示，我们生成了 NanoLuc 荧光素酶和 TurboGFP 标记的报告细胞系。
更新日期：2015-12-20
中文翻译：
CRISPR-Cas9 介导的基因标记的通用策略。
Cas9 核酸内切酶的可用性大大增强了基因组工程，该酶可以使用所谓的引导 RNA (gRNA) 靶向几乎任何基因组位点。然而，引入外源DNA序列来标记内源基因仍然很麻烦，因为它需要合成或克隆同源模板。在这里，我们提出了一种策略，可以使用一个通用供体质粒来标记内源基因座。它包含感兴趣的标签，两侧是两个 gRNA 识别位点，允许从质粒中切除标签。用 Cas9、指定感兴趣基因组位点的 gRNA、供体质粒和盒特异性 gRNA 共转染细胞，通过同源独立机制触发标签的插入。该策略非常有效，并提供显示可预测集成模式的克隆。作为展示，我们生成了 NanoLuc 荧光素酶和 TurboGFP 标记的报告细胞系。
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