摘要 副溶血性弧菌是一种世界性病原体，已被证明能够进入可存活但不可培养（VBNC）状态并在压力条件下存活。在这项研究中，开发了一种实时定量 PCR 与单叠氮化丙啶 (PMA-qPCR) 结合的方法，并评估了对副溶血性弧菌 VBNC 细胞的可靠定量。通过PMA-qPCR和qPCR检测不同比例的活细胞和死细胞的样品以评估该方法。然后将该方法用于监测副溶血性弧菌的 VBNC 诱导过程，并通过荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 观察、流式细胞术 (FCM) 分析对活细胞进行量化，同时确认细胞完整性和呼吸活性。此外，验证了该方法的适用性，以检测具有不同副溶血性弧菌状态的人为污染的海鲜样品。结果表明，最佳的 PMA 处理条件是在黑暗中进行 5 分钟的 PMA 孵育，然后是 15 分钟的光照。这种方法可以显着区分活细胞和死细胞，并具体列举活细胞。通过PMA-qPCR方法，成功监测了VBNC诱导过程中细胞数量的变化。4 ℃培养的 3% NaCl 无菌细胞进入 VBNC 状态，诱导第 5 天检测到 106 cell/mL VBNC 细胞（原活细胞的 10%），则 VBNC 细胞密度为在第 40 天未观察到可培养细胞时为 5.8 × 104 cell/mL。FCM 分析显示 VBNC 细胞的活力，在 CLSM 下通过 CTC/DAPI 染色也观察到红色显示呼吸活动。对于检测不同状态的副溶血性弧菌的加标海鲜样品（虾、鲳鱼和扇贝），它可以检测低至 1.2 × 102 cell/g 的副溶血性弧菌的存活或 VBNC 状态，而不受食物的干扰基质和死细胞。总之，本研究中开发的 PMA-qPCR 方法可快速可靠地量化副溶血性弧菌的 VBNC 细胞。副溶血性，不受食物基质和死细胞的干扰。总之，本研究中开发的 PMA-qPCR 方法可快速可靠地量化副溶血性弧菌的 VBNC 细胞。副溶血性，不受食物基质和死细胞的干扰。总之，本研究中开发的 PMA-qPCR 方法可快速可靠地量化副溶血性弧菌的 VBNC 细胞。



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