Manganese superoxide dismutase (MnSOD) upregulating FoxM1 have previously been demonstrated promoting lung cancer stemness. Isovitexin exhibits antitumor activities in various cancers. This study aimed to assess whether isovitexin inhibits hepatic carcinoma stem-like cells (HCSLCs) features via regulating MnSOD and FoxM1 expression. Second-generation spheres from the hepatic carcinoma cell lines, respectively, were used as HCSLCs. Protein amounts of MnSOD, FoxM1 and stemness-associated markers (CD133, CD44, ALDH1, Bmi1, Nanog and Oct4) were determined by immunoblotting. In vitro carcinogenicity was evaluated by sphere- and colony-formation assays. The effects of isovitexin on HCSLC carcinogenicity and stemness were examined in vitro and in xenograft models. An adenoviral delivery system was employed to manipulate MnSOD and/or FoxM1. Luciferase reporter assay was performed to verify isovitexin downregulated FoxM1 by inhibiting MnSOD-mediated effects of E2F1 and/or Sp1 on activation of FoxM1 promoter. FoxM1 upregulation by MnSOD contributed to carcinogenicity and stemness, with increased sphere- and colony-formation capabilities, upregulated stemness-associated markers and CD133+ subpopulation as well as elevated oncogenicity in vivo in HCSLCs compared with hepatic carcinoma cells. Isovitexin substantially decreased sphere and colony formation rates, and stemness-associated markers in cultured HCSLCs by suppressing MnSOD and FoxM1 expression. Importantly, isovitexin significantly inhibited tumor growth of in nude mice bearing HCSLCs and reduced CD133 protein expression of xenograft in nude mice. MnSOD or FoxM1 knockdown enhanced the effects of isovitexin suppression on carcinogenicity and stemness in HCSLC. MnSOD or FoxM1 overexpression attenuated the effects of isovitexin. Additionally, isovitexin and MnSOD knockdown could inhibit FoxM1 reporter activity via a decreased binding of E2F1 and/or Sp1 onto FoxM1 promoter. FoxM1 overexpression reversed the effects of isovitexin combined with MnSOD knockdown, without affecting MnSOD expression. Moreover, MnSOD knockdown plus thiostrepton, a FoxM1 specific inhibitor, cooperated with isovitexin to repress xenograft tumor growth and downregulate MnSOD and FoxM1 in nude mice bearing HCSLCs from MHCC97H cells. Isovitexin inhibits carcinogenicity and stemness in HCSLCs by downregulating FoxM1via inhibition of MnSOD.

中文翻译：

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异牡荆素通过调节 MnSOD 和 FoxM1 降低肝癌干细胞样细胞的致癌性和干性

先前已证明上调 FoxM1 的锰超氧化物歧化酶 (MnSOD) 可促进肺癌干性。Isovitexin 在各种癌症中表现出抗肿瘤活性。本研究旨在评估异牡荆素是否通过调节 MnSOD 和 FoxM1 的表达来抑制肝癌干细胞样细胞 (HCSLCs) 的特征。来自肝癌细胞系的第二代球体分别用作HCSLC。通过免疫印迹测定 MnSOD、FoxM1 和干性相关标志物（CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、Nanog 和 Oct4）的蛋白质量。通过球体和菌落形成试验评估体外致癌性。在体外和异种移植模型中检查了异牡荆素对 HCSLC 致癌性和干性的影响。采用腺病毒递送系统来操纵 MnSOD 和/或 FoxM1。进行萤光素酶报告基因测定以通过抑制 MnSOD 介导的 E2F1 和/或 Sp1 对 FoxM1 启动子激活的影响来验证异牡荆素下调 FoxM1。与肝癌细胞相比，MnSOD 对 FoxM1 的上调有助于致癌性和干性，增加球体和集落形成能力，上调干性相关标志物和 CD133+ 亚群，以及在 HCSLC 中提高体内致癌性。Isovitexin 通过抑制 MnSOD 和 FoxM1 的表达，显着降低了培养的 HCSLC 中球体和菌落形成率以及干性相关标志物。重要的是，异牡荆素显着抑制了携带 HCSLC 的裸鼠的肿瘤生长，并降低了裸鼠异种移植物的 CD133 蛋白表达。MnSOD 或 FoxM1 敲低增强了异牡荆素抑制对 HCSLC 致癌性和干性的影响。MnSOD 或 FoxM1 过表达减弱了异牡荆素的作用。此外，异牡荆素和 MnSOD 敲低可以通过减少 E2F1 和/或 Sp1 与 FoxM1 启动子的结合来抑制 FoxM1 报告基因的活性。FoxM1 过表达逆转了异牡荆素联合 MnSOD 敲低的作用，而不影响 MnSOD 的表达。此外，MnSOD 敲低加上 FoxM1 特异性抑制剂 thiostrepton 与异牡荆素合作抑制异种移植肿瘤生长并下调携带来自 MHCC97H 细胞的 HCSLC 的裸鼠中的 MnSOD 和 FoxM1。Isovitexin 通过抑制 MnSOD 下调 FoxM1 来抑制 HCSLC 的致癌性和干性。MnSOD 或 FoxM1 过表达减弱了异牡荆素的作用。此外，异牡荆素和 MnSOD 敲低可以通过减少 E2F1 和/或 Sp1 与 FoxM1 启动子的结合来抑制 FoxM1 报告基因的活性。FoxM1 过表达逆转了异牡荆素联合 MnSOD 敲低的作用，而不影响 MnSOD 的表达。此外，MnSOD 敲低加上 FoxM1 特异性抑制剂 thiostrepton 与异牡荆素合作抑制异种移植肿瘤生长并下调携带来自 MHCC97H 细胞的 HCSLC 的裸鼠中的 MnSOD 和 FoxM1。Isovitexin 通过抑制 MnSOD 下调 FoxM1 来抑制 HCSLC 的致癌性和干性。MnSOD 或 FoxM1 过表达减弱了异牡荆素的作用。此外，异牡荆素和 MnSOD 敲低可以通过减少 E2F1 和/或 Sp1 与 FoxM1 启动子的结合来抑制 FoxM1 报告基因的活性。FoxM1 过表达逆转了异牡荆素联合 MnSOD 敲低的作用，而不影响 MnSOD 的表达。此外，MnSOD 敲低加上 FoxM1 特异性抑制剂 thiostrepton 与异牡荆素合作抑制异种移植肿瘤生长并下调携带来自 MHCC97H 细胞的 HCSLC 的裸鼠中的 MnSOD 和 FoxM1。Isovitexin 通过抑制 MnSOD 下调 FoxM1 来抑制 HCSLC 的致癌性和干性。FoxM1 过表达逆转了异牡荆素联合 MnSOD 敲低的作用，而不影响 MnSOD 的表达。此外，MnSOD 敲低加上 FoxM1 特异性抑制剂 thiostrepton 与异牡荆素合作抑制异种移植肿瘤生长并下调携带来自 MHCC97H 细胞的 HCSLC 的裸鼠中的 MnSOD 和 FoxM1。Isovitexin 通过抑制 MnSOD 下调 FoxM1 来抑制 HCSLC 的致癌性和干性。FoxM1 过表达逆转了异牡荆素联合 MnSOD 敲低的作用，而不影响 MnSOD 的表达。此外，MnSOD 敲低加上 FoxM1 特异性抑制剂 thiostrepton 与异牡荆素合作抑制异种移植肿瘤生长并下调携带来自 MHCC97H 细胞的 HCSLC 的裸鼠中的 MnSOD 和 FoxM1。Isovitexin 通过抑制 MnSOD 下调 FoxM1 来抑制 HCSLC 的致癌性和干性。