可编程核酸酶通过利用内源性DNA双链断裂（DSB）修复途径使基因组工程化。尽管同源重组（HR）介导的基因敲入已被很好地建立，但由于HR频率可变，因此不一定适用于每种细胞类型和生物体。最近，我们报道了另一种基因敲入方法，称为PITCh（精确整合入目标染色体）系统，并辅以微同源性介导的末端连接（MMEJ）。MMEJ利用了来自HR的独立机制，并且它需要极短的同源序列（5-25 bp）来进行DSB修复，从而可以通过更容易构建的供体载体进行精确的基因敲入。在这里，我们描述了用于PITCh敲入的简化协议，包括PITCh载体的设计和构建，并通过转染将其递送至人细胞系，或通过显微注射将其递送至青蛙胚胎。PITCh载体的构建仅需几天，整个过程大约需要1.5个月才能建立敲入的细胞，或者从注射到青蛙胚胎的早期基因分型大约需要1周。



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