Effective detection of thymine DNA glycosylase (TDG) activity is extremely crucial and urgent for epigenetic research. Herein, a novel label-free electrogenerated chemiluminescence (ECL) biosensing method was developed for the detection of TDG activity using DNA-functionalized gold nanoparticles (DNA-AuNPs) triggered hybridization chain reaction (HCR). In this assay, the thiol modified hairpin probe DNA (hp-DNA) with 5' overhangs and one mismatched base pair of guanines: thymine (G: T) in the stem part was boned onto gold electrode. TDG specifically removed T base of the G: T mismatch to produce apyrimidinic (AP) sites through the N-glycosidic bond hydrolysis. The AP site was then cleaved by the catalysis of Endonuclease IV (EnIV) to generate dsDNA containing a free 3' end in the long sequence, which serves as a complementary sequence to hybridize with the specific sequence (ssDNA1) of DNA-AuNPs. Then, the functionalized DNA-AuNPs with initiator strands (ssDNA2) could trigger HCR to form nicked double helices DNA polymer which can embed numerous ECL indicator, Ru(phen)32+, resulting in significantly increased ECL signal. The proposed strategy combined the amplification function of DNA-AuNPs triggered HCR and the inherent high sensitivity of the ECL technique, a detection limit of 1.1 × 10-5 U/μL (0.0028 ng/mL) for TDG determination was obtained. In addition, this method was successfully applied to evaluate TDG activity in cancer cell, which provides great possibility for TDG activity assay in related clinical diagnostics.

中文翻译：

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使用 DNA 功能化金纳米粒子触发杂交链反应检测胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶活性的无标记和放大电生化学发光生物传感

有效检测胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶 (TDG) 活性对于表观遗传研究极为重要和紧迫。在此，开发了一种新的无标记电致化学发光 (ECL) 生物传感方法，用于使用 DNA 功能化金纳米粒子 (DNA-AuNPs) 触发的杂交链反应 (HCR) 检测 TDG 活性。在该测定中，硫醇修饰的发夹探针 DNA (hp-DNA) 具有 5' 突出端和一对错配的鸟嘌呤：茎部分中的胸腺嘧啶 (G: T) 被连接到金电极上。TDG 特异性去除 G:T 错配的 T 碱基，通过 N-糖苷键水解产生无嘧啶 (AP) 位点。然后通过核酸内切酶 IV (EnIV) 的催化切割 AP 位点，生成在长序列中含有游离 3' 末端的 dsDNA，它作为互补序列与 DNA-AuNPs 的特定序列 (ssDNA1) 杂交。然后，带有起始链 (ssDNA2) 的功能化 DNA-AuNPs 可以触发 HCR 形成带切口的双螺旋 DNA 聚合物，该聚合物可以嵌入许多 ECL 指示剂 Ru(phen)32+，导致 ECL 信号显着增加。所提出的策略结合了 DNA-AuNPs 触发 HCR 的放大功能和 ECL 技术固有的高灵敏度，获得了 1.1 × 10-5 U/μL (0.0028 ng/mL) 的 TDG 测定检测限。此外，该方法已成功应用于评价癌细胞中的TDG活性，为相关临床诊断中的TDG活性测定提供了很大的可能性。带有起始链 (ssDNA2) 的功能化 DNA-AuNPs 可以触发 HCR 形成带切口的双螺旋 DNA 聚合物，该聚合物可以嵌入许多 ECL 指示剂 Ru(phen)32+，导致 ECL 信号显着增加。所提出的策略结合了 DNA-AuNPs 触发 HCR 的放大功能和 ECL 技术固有的高灵敏度，获得了 1.1 × 10-5 U/μL (0.0028 ng/mL) 的 TDG 测定检测限。此外，该方法已成功应用于评价癌细胞中的TDG活性，为相关临床诊断中的TDG活性测定提供了很大的可能性。带有起始链 (ssDNA2) 的功能化 DNA-AuNPs 可以触发 HCR 形成带切口的双螺旋 DNA 聚合物，该聚合物可以嵌入许多 ECL 指示剂 Ru(phen)32+，导致 ECL 信号显着增加。所提出的策略结合了 DNA-AuNPs 触发 HCR 的放大功能和 ECL 技术固有的高灵敏度，获得了 1.1 × 10-5 U/μL (0.0028 ng/mL) 的 TDG 测定检测限。此外，该方法已成功应用于评价癌细胞中的TDG活性，为相关临床诊断中的TDG活性测定提供了很大的可能性。所提出的策略结合了 DNA-AuNPs 触发 HCR 的放大功能和 ECL 技术固有的高灵敏度，获得了 1.1 × 10-5 U/μL (0.0028 ng/mL) 的 TDG 测定检测限。此外，该方法已成功应用于评价癌细胞中的TDG活性，为相关临床诊断中的TDG活性测定提供了很大的可能性。所提出的策略结合了 DNA-AuNPs 触发 HCR 的放大功能和 ECL 技术固有的高灵敏度，获得了 1.1 × 10-5 U/μL (0.0028 ng/mL) 的 TDG 测定检测限。此外，该方法已成功应用于评价癌细胞中的TDG活性，为相关临床诊断中的TDG活性测定提供了很大的可能性。