乙酰丙酮（3-羟基-2-丁酮）是一种重要的生物基平台化学品，具有广泛的应用。体外酶催化合成在生产高纯度化学品中显示出极大的可行性。在目前的工作中，体外构建了包括两步连续反应的合成途径，用于在提高的温度下从丙酮酸生产乙酰丁酸酯。克隆，异源表达并表征了热稳定的候选蛋白，乙酰乳酸合酶（来自Caldicellulosiruptor owensensis OL的coAHASL1和coAHASL2）和α-乙酰乳酸脱羧酶（来自枯草芽孢杆菌IPE5-4的bsALDC）。所有的酶在65-70°C和pH值为6.5时显示最大活性。酶动力学分析表明，与coAHASL2相比，coAHASL1具有较高的活性，但对丙酮酸的亲和力较低。此外，²⁺和NADPH。基于coAHASL1和bsALDC的动力学特性，优化了级联酶促反应。在最佳条件下，在65°C下反应24小时后，由10 mM丙酮酸盐产生的最大浓度为3.36±0.26 mM乙酰丙酮。丙酮的产率为0.14mM h ^-1，与理论值相比产率为67.80％。结果证实了用无细胞酶催化系统在较高的温度下从丙酮酸合成乙酰丁酸酯的可行性。



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