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Microfluidic System for In-Flow Reversible Photoswitching of Near-Infrared Fluorescent Proteins
Analytical Chemistry ( IF 6.7 ) Pub Date : 2016-11-16 00:00:00 , DOI: 10.1021/acs.analchem.6b03499 Vladislav V. Lychagov , Anton A. Shemetov , Ralph Jimenez , Vladislav V. Verkhusha 1
Analytical Chemistry ( IF 6.7 ) Pub Date : 2016-11-16 00:00:00 , DOI: 10.1021/acs.analchem.6b03499 Vladislav V. Lychagov , Anton A. Shemetov , Ralph Jimenez , Vladislav V. Verkhusha 1
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We have developed a microfluidic flow cytometry system to screen reversibly photoswitchable fluorescent proteins for contrast and stability of reversible photoconversion between high- and low-fluorescent states. A two-color array of 20 excitation and deactivation beams generated with diffractive optics was combined with a serpentine microfluidic channel geometry designed to provide five cycles of photoswitching with real-time calculation of photoconversion fluorescence contrast. The characteristics of photoswitching in-flow as a function of excitation and deactivation beam fluence, flow speed, and protein concentration were studied with droplets of the bacterial phytochrome from Deinococcus radiodurans (DrBphP), which is weakly fluorescent in the near-infrared (NIR) spectral range. In agreement with measurements on stationary droplets and HeLa S3 mammalian cells expressing DrBphP, optimized operation of the flow system provided up to 50% photoconversion contrast in-flow at a droplet rate of few hertz and a coefficient of variation (CV) of up to 2% over 10 000 events. The methods for calibrating the brightness and photoswitching measurements in microfluidic flow established here provide a basis for screening of cell-based libraries of reversibly switchable NIR fluorescent proteins.
中文翻译：
微流控系统用于近红外荧光蛋白的流内可逆光开关
我们已经开发了一种微流式细胞仪系统，以筛选可逆光转换的荧光蛋白，以在高荧光状态和低荧光状态之间进行可逆光转换的对比度和稳定性。将由衍射光学器件产生的20个激发和失活光束的双色阵列与蛇形微流体通道几何形状相结合，该几何形状旨在提供5个光开关周期，并实时计算光转换荧光对比度。用来自放射线虫（Deinococcus radiodurans）的细菌性植物色素液滴研究了光开关流入的特性与激发和失活束通量，流速和蛋白质浓度的关系。（DrBphP），在近红外（NIR）光谱范围内发出微弱的荧光。与对固定液滴和表达DrBphP的HeLa S3哺乳动物细胞的测量相一致，流动系统的优化操作以几赫兹的液滴速率和高达2的变异系数（CV）提供了高达50％的光转换对比度流入。 ％超过10000个事件。此处建立的用于校准微流中亮度和光开关测量值的方法为筛选可逆可转换NIR荧光蛋白的基于细胞的文库提供了基础。
更新日期：2016-11-16
中文翻译：
微流控系统用于近红外荧光蛋白的流内可逆光开关
我们已经开发了一种微流式细胞仪系统，以筛选可逆光转换的荧光蛋白，以在高荧光状态和低荧光状态之间进行可逆光转换的对比度和稳定性。将由衍射光学器件产生的20个激发和失活光束的双色阵列与蛇形微流体通道几何形状相结合，该几何形状旨在提供5个光开关周期，并实时计算光转换荧光对比度。用来自放射线虫（Deinococcus radiodurans）的细菌性植物色素液滴研究了光开关流入的特性与激发和失活束通量，流速和蛋白质浓度的关系。（DrBphP），在近红外（NIR）光谱范围内发出微弱的荧光。与对固定液滴和表达DrBphP的HeLa S3哺乳动物细胞的测量相一致，流动系统的优化操作以几赫兹的液滴速率和高达2的变异系数（CV）提供了高达50％的光转换对比度流入。 ％超过10000个事件。此处建立的用于校准微流中亮度和光开关测量值的方法为筛选可逆可转换NIR荧光蛋白的基于细胞的文库提供了基础。
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