We developed a new method for stable carbon and nitrogen isotopic (δ¹³C and δ¹⁵N) analysis of underivatized amino acid (AA) enantiomers simultaneously, based on high-performance liquid chromatography (HPLC) separation and off-line isotopic measurement. l- and d-Enantiomers of each AA were isolated using a ReproSil Chiral-AA column, purified by wet chemical procedure, and analyzed for δ¹³C and δ¹⁵N values with a nanomol-scale elemental analyzer/isotope-ratio mass spectrometry (nano-EA/IRMS) system. We successfully achieved the separation of l- and d-enantiomers of 15 proteinogenous AAs, with all l-enantiomers eluting before respective d-enantiomers. The δ¹³C and δ¹⁵N values of AA enantiomers were consistent before and after HPLC separation, demonstrating that this analytical method conserves isotopic information. By coupling this column with a multidimensional HPLC system for isolating individual AAs, we analyzed l- and d-AAs in a natural sample, peptidoglycan isolated from Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Results show a surprisingly large ¹⁵N-depletion, up to 20‰, in d-glutamic acid relative to its l-counterpart. The first example, to our knowledge, of δ¹³C and δ¹⁵N analyses of underivatized AA enantiomers is expected to contribute to various research areas in the future.

中文翻译：

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通过 HPLC + HPLC 分离和 nano-EA/IRMS 对未衍生化的单个 L 和 D 氨基酸进行对映体特异性稳定碳和氮同位素分析


我们开发了一种基于高效液相色谱 （HPLC） 分离和离线同位素测量的稳定碳和氮同位素 （δ¹³C 和 δ¹⁵N） 对映异构体同时分析未衍生化氨基酸 （AA） 对映异构体的新方法。使用 ReproSil 手性 AA 柱分离每种 AA 的 l 对映异构体和 d-对映异构体，通过湿化学程序纯化，并使用纳摩尔级元素分析仪/同位素比质谱 （nano-EA/IRMS） 系统分析δ¹³C 和 δ¹⁵N 值。我们成功地分离了 15 个蛋白原产性 AA 的 l-和 d-对映异构体，所有 l-对映异构体都在各自的 d-对映异构体之前洗脱。HPLC 分离前后 AA 对映异构体的 δ¹³C 和 δ¹⁵N 值一致，表明该分析方法保留了同位素信息。通过将该色谱柱与用于分离单个 AA 的多维 HPLC 系统相结合，我们分析了天然样品中的 l- 和 d-AAs，即从革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌中分离的肽聚糖。结果显示，相对于 l-谷氨酸，d-谷氨酸的 ¹⁵N-消耗量惊人地大，高达 20‰。据我们所知，未衍生化 AA 对映异构体的 δ¹³C 和 δ¹⁵N 分析的第一个示例有望在未来为各个研究领域做出贡献。