The universal N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) at position 37 of tRNAs is one of core post-transcriptional modifications that are needed for promoting translational fidelity. In bacteria, TsaC utilizes L-threonine, bicarbonate and ATP to generate an intermediate threonylcarbamoyladenylate (TC-AMP), of which the TC-moiety is transferred to N6 atom of tRNA A37 to generate t6A by TsaD with support of TsaB and TsaE. TsaD and TsaB form a TsaDB dimer to which tRNA and TsaE are competitively bound. The catalytic mechanism of TsaD and auxiliary roles of TsaB and TsaE remain to be fully elucidated. In this study, we reconstituted tRNA t6A biosynthesis using recombinant TsaC, TsaD-TsaB and TsaE from thermophilic Aquifex aeolicus and determined crystal structures of apo-form and ADP-bound form of TsaD2B2 tetramer. Our TsaD2B2-TsaE-tRNA model coupled functional validations reveal that the binding of tRNA or TsaE to TsaDB is regulated by C-terminal tail of TsaB and a helical hairpin α1-α2 of TsaD. A. aeolicus TsaD2B2 or TsaDB possesses a basal divalent ion-dependent t6A-catalytic activity that is stimulated by TsaE at the cost of ATP consumption. Our data suggest that binding of TsaE to TsaDB induces conformational changes of α1, α2, α6, α7 and α8 of TsaD and C-terminal tail of TsaB, leading to release of tRNA t6A and AMP. ATP hydrolysis-driven dissociation of TsaE from TsaDB resets an active conformation of TsaDB. Dimerization of thermophilic TsaDB enhances thermostability and promotes t6A-catalytic activity of TsaD2B2-tRNA, of which GC base pairs in anticodon stem are needed for correct folding of thermophilic tRNA at higher temperatures.

中文翻译：

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Aquifex aeolicus TsaD2B2 四聚体与 TsaE 复合物中 tRNA t6A 催化、组装和热稳定性的结构-功能分析。


tRNA 第 37 位的通用 N6-苏糖基氨基甲酰腺苷 （t6A） 是促进翻译保真度所需的核心转录后修饰之一。在细菌中，TsaC 利用 L-苏氨酸、碳酸氢盐和 ATP 生成中间苏糖基氨基甲酰腺苷酸 （TC-AMP），其中 TC 部分转移到 tRNA A37 的 N6 原子上，在 TsaB 和 TsaE 的支持下通过 TsaD 生成 t6A。TsaD 和 TsaB 形成 TsaDB 二聚体，tRNA 和 TsaE 与其竞争结合。TsaD 的催化机制以及 TsaB 和 TsaE 的辅助作用仍有待完全阐明。在这项研究中，我们使用来自嗜热 Aquifex aeolicus 的重组 TsaC 、 TsaD-TsaB 和 TsaE 重构了 tRNA t6A 生物合成，并确定了 TsaD2B2 四聚体的载脂型和 ADP 结合形式的晶体结构。我们的 TsaD2B2-TsaE-tRNA 模型耦合功能验证表明，tRNA 或 TsaE 与 TsaDB 的结合受 TsaB 的 C 末端尾部和 TsaD 的螺旋发夹 α1-α2 的调节。A. aeolicus TsaD2B2 或 TsaDB 具有基础二价离子依赖性 t6A 催化活性，由 TsaE 刺激，代价是消耗 ATP。我们的数据表明，TsaE 与 TsaDB 的结合诱导 TsaD 的 α1、α2、α6、α7 和 α8 以及 TsaB 的 C 末端尾部的构象变化，导致 tRNA t6A 和 AMP 的释放。ATP 水解驱动的 TsaE 与 TsaDB 的解离重置了 TsaDB 的活性构象。嗜热 TsaDB 的二聚化增强了热稳定性并促进了 TsaD2B2-tRNA 的 t6A 催化活性，其中反密码子茎中的 GC 碱基对是在较高温度下正确折叠嗜热 tRNA 所必需的。