The CRISPR-Cas-based gene targeting (GT) method has enabled precise modifications of genomic DNA ranging from single base to several kilobase scales through homologous recombination (HR). In plant somatic cells, canonical nonhomologous end-joining (cNHEJ) is the predominant mechanism for repairing double-stranded breaks (DSBs), thus limiting the HR-mediated GT. In this study, we implemented an approach to shift the repair pathway preference toward HR by using a dominant-negative ku80 mutant protein (KUDN) to disrupt the initiation of cNHEJ. The employment of KUDN conferred a 1.71- to 3.55-fold improvement in GT efficiency at the callus stage. When we screened transformants, there was a more remarkable increase in GT efficiency, ranging from 1.62- to 9.84-fold, at two specific tomato loci, SlHKT1;2 and SlEPSPS1. With practical levels of efficiency, this enhanced KUDN-based GT tool successfully facilitated a 9-bp addition at an additional locus, SlCAB13. These findings provide another promising method for more efficient and precise plant breeding.

中文翻译：

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使用显性阴性 ku80 增强番茄中基于 CRISPR-Cas 的基因靶向


基于 CRISPR-Cas 的基因靶向 （GT） 方法通过同源重组 （HR） 实现了从单个碱基到几千碱基规模的基因组 DNA 的精确修饰。在植物体细胞中，经典非同源末端连接 （cNHEJ） 是修复双链断裂 （DSB） 的主要机制，从而限制了 HR 介导的 GT。在这项研究中，我们实施了一种通过使用显性阴性 ku80 突变蛋白 （KUDN） 来破坏 cNHEJ 的启动，从而将修复途径偏好转向 HR。使用 KUDN 使愈伤组织阶段的 GT 效率提高了 1.71 至 3.55 倍。当我们筛选转化体时，在两个特定的番茄基因座 SlHKT1 上，GT 效率提高了 1.62 倍到 9.84 倍;2 和 SlEPSPS1。凭借实际效率水平，这种基于 KUDN 的增强型 GT 工具成功地促进了另一个基因座 SlCAB13 的 9 bp 添加。这些发现为更高效、更精确的植物育种提供了另一种有前途的方法。