RNA polymerase II (pol II) initiates transcription from transcription start sites (TSSs) located ∼30–35 bp downstream of the TATA box in metazoans, whereas in the yeast Saccharomyces cerevisiae, pol II scans further downstream TSSs located ∼40–120 bp downstream of the TATA box. Previously, we found that removal of the kinase module TFIIK (Kin28–Ccl1–Tfb3) from TFIIH shifts the TSS in a yeast in vitro system upstream to the location observed in metazoans and that addition of recombinant Tfb3 back to TFIIH-ΔTFIIK restores the downstream TSS usage. Here, we report that this biochemical activity of yeast TFIIK in TSS scanning is attributable to the Tfb3 RING domain at the interface with pol II in the pre-initiation complex (PIC): especially, swapping Tfb3 Pro51—a residue conserved among all fungi—with Ala or Ser as in MAT1, the metazoan homolog of Tfb3, confers an upstream TSS shift in vitro in a similar manner to the removal of TFIIK. Yeast genetic analysis suggests that both Pro51 and Arg64 of Tfb3 are required to maintain the stability of the Tfb3–pol II interface in the PIC. Cryo-electron microscopy analysis of a yeast PIC lacking TFIIK reveals considerable variability in the orientation of TFIIH, which impairs TSS scanning after promoter opening.

中文翻译：

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转录起始位点扫描需要 Tfb3 的真菌特异性疏水环


RNA 聚合酶 II （pol II） 从位于后生动物 TATA 盒下游约 30-35 bp 的转录起始位点 （TSS） 开始转录，而在酵母酿酒酵母中，pol II 扫描位于 TATA 盒下游 ∼40-120 bp 的下游 TSS。以前，我们发现从 TFIIH 中去除激酶模块 TFIIK （Kin28-Ccl1-Tfb3） 会使酵母体外系统中的 TSS 上游移动到后生动物中观察到的位置，并且将重组 Tfb3 添加回 TFIIH-ΔTFIIK 恢复下游 TSS 的使用。在这里，我们报道了酵母 TFIIK 在 TSS 扫描中的这种生化活性归因于起始前复合物 （PIC） 中与 pol II 界面处的 Tfb3 RING 结构域：特别是，将 Tfb3 Pro51（一种在所有真菌中保守的残基）与 Tfb3 的后生动物同源物 MAT1 中的 Ala 或 Ser 交换，在体外以类似于去除 TFIIK 的方式赋予上游 TSS 偏移。酵母遗传分析表明，Tfb3 的 Pro51 和 Arg64 都是维持 PIC 中 Tfb3-pol II 界面稳定性所必需的。缺乏 TFIIK 的酵母 PIC 的冷冻电子显微镜分析显示 TFIIH 方向存在相当大的变异性，这会损害启动子打开后的 TSS 扫描。