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CILF: CRISPR/Cas9 based integration of large DNA fragments in Saccharomyces cerevisiae
Biotechnology and Bioengineering ( IF 3.5 ) Pub Date : 2024-08-18 , DOI: 10.1002/bit.28830 Shijie Xu 1 , Jie Meng 1, 2 , Qi Zhang 1 , Baisong Tong 1 , Zihe Liu 1 , Jinyu Fu 1 , Shuobo Shi 1
Biotechnology and Bioengineering ( IF 3.5 ) Pub Date : 2024-08-18 , DOI: 10.1002/bit.28830 Shijie Xu 1 , Jie Meng 1, 2 , Qi Zhang 1 , Baisong Tong 1 , Zihe Liu 1 , Jinyu Fu 1 , Shuobo Shi 1
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Genome integration technology has markedly expedited the construction of cell factories. However, its application is currently limited by the inefficient integration of large DNA fragments. Here, we report a CRISPR/Cas9 based integration of large DNA fragments (CILF) method to efficiently integrate large DNA fragments in Saccharomyces cerevisiae. In this approach, a fusion protein, Cas9-Brex27-FadR, was employed for the targeted delivery of donor plasmid to double-strand breaks (DSBs), while simultaneously recruiting Rad51 to enhance the efficiency of homologous recombination (HR). Our findings demonstrate that this method can achieve an integration efficiency of 98% for 10 kb DNA fragments and nearly 80% for 40 kb DNA fragments at a single site, using donor plasmids with 1000 bp homology arms (HAs) and 12 FadR binding sites (BSs). The CILF technique significantly enriches the synthetic biology toolbox of S. cerevisiae, offering significant potential to propel advancements in both synthetic biology and metabolic engineering.
中文翻译：
CILF：酿酒酵母中基于 CRISPR/Cas9 的大 DNA 片段整合
基因组整合技术显著加快了细胞工厂的建设。然而，其应用目前受到大 DNA 片段低效整合的限制。在这里，我们报道了一种基于 CRISPR/Cas9 的大 DNA 片段整合 （CILF） 方法，以有效地将大 DNA 片段整合到酿酒酵母中。在这种方法中，融合蛋白 Cas9-Brex27-FadR 用于将供体质粒靶向递送至双链断裂 （DSB），同时募集 Rad51 以提高同源重组 （HR） 的效率。我们的研究结果表明，使用具有 1000 bp 同源臂 （HAs） 和 12 个 FadR 结合位点 （BSs） 的供体质粒，该方法可以在单个位点实现 98% 的 10 kb DNA 片段整合效率，40 kb DNA 片段的整合效率接近 12%。CILF 技术显著丰富了酿酒酵母的合成生物学工具箱，为推动合成生物学和代谢工程的进步提供了巨大的潜力。
更新日期：2024-08-18
中文翻译：
CILF：酿酒酵母中基于 CRISPR/Cas9 的大 DNA 片段整合
基因组整合技术显著加快了细胞工厂的建设。然而，其应用目前受到大 DNA 片段低效整合的限制。在这里，我们报道了一种基于 CRISPR/Cas9 的大 DNA 片段整合 （CILF） 方法，以有效地将大 DNA 片段整合到酿酒酵母中。在这种方法中，融合蛋白 Cas9-Brex27-FadR 用于将供体质粒靶向递送至双链断裂 （DSB），同时募集 Rad51 以提高同源重组 （HR） 的效率。我们的研究结果表明，使用具有 1000 bp 同源臂 （HAs） 和 12 个 FadR 结合位点 （BSs） 的供体质粒，该方法可以在单个位点实现 98% 的 10 kb DNA 片段整合效率，40 kb DNA 片段的整合效率接近 12%。CILF 技术显著丰富了酿酒酵母的合成生物学工具箱，为推动合成生物学和代谢工程的进步提供了巨大的潜力。
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