Nature’s two redox cofactors, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD⁺) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP⁺), are held at different reduction potentials, driving catabolism and anabolism in opposite directions. In biomanufacturing, there is a need to flexibly control redox reaction direction decoupled from catabolism and anabolism. We established nicotinamide mononucleotide (NMN⁺) as a noncanonical cofactor orthogonal to NAD(P)⁺. Here we present the development of Nox Ortho, a reduced NMN⁺ (NMNH)-specific oxidase, that completes the toolkit to modulate NMNH:NMN⁺ ratio together with an NMN⁺-specific glucose dehydrogenase (GDH Ortho). The design principle discovered from Nox Ortho engineering and modeling is facilely translated onto six different enzymes to create NMN(H)-orthogonal biocatalysts with a consistent ~10³–10⁶-fold cofactor specificity switch from NAD(P)⁺ to NMN⁺. We assemble these enzymes to produce stereo-pure 2,3-butanediol in cell-free systems and in Escherichia coli, enabled by NMN(H)’s distinct redox ratio firmly set by its designated driving forces, decoupled from both NAD(H) and NADP(H).

自然界的两种氧化还原辅因子，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD⁺） 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NADP⁺），保持不同的还原电位，驱动分解代谢和合成代谢向相反的方向发展。在生物制造中，需要灵活控制与分解代谢和合成代谢解耦的氧化还原反应方向。我们将烟酰胺单核苷酸 （NMN⁺） 确定为与 NAD（P）⁺ 正交的非经典辅因子。在这里，我们介绍了 Nox Ortho 的开发，这是一种还原的 NMN ⁺ （NMNH） 特异性氧化酶，它完成了调节 NMNH：NMN ⁺ 比率以及 NMN ⁺ 特异性葡萄糖脱氢酶 （GDH Ortho） 的工具包。从 Nox Ortho 工程和建模中发现的设计原理很容易地转化为六种不同的酶，以产生 NMN（H） -正交生物催化剂，具有从 NAD（P）⁺ 到 NMN⁺ 的一致 ~10^{3-10 6} 倍辅因子特异性转换。我们将这些酶组装起来，在无细胞系统和大肠杆菌中产生立体纯的 2,3-丁二醇，这得益于 NMN（H） 独特的氧化还原比率，该比率由其指定的驱动力牢牢设定，与 NAD（H） 和 NADP（H） 解耦。