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A candidate reference measurement procedure for the quantification of α-synuclein in cerebrospinal fluid using an SI traceable primary calibrator and multiple reaction monitoring
Analyst ( IF 3.6 ) Pub Date : 2024-07-23 , DOI: 10.1039/d4an00634h Leran Zhang 1 , Eva Illes-Toth 1 , Adam Cryar 1 , Giles Drinkwater 1 , Lucia Di Vagno 1 , Marie-Laure Pons 2 , Julia Mateyka 1 , Bryan McCullough 1 , Eli Achtar 1 , Cailean Clarkson 1 , Laura Göschel 3, 4 , Peter Körtvélyessy 3, 5 , Chris Mussell 1 , Christopher J Hopley 1 , Agnes Flöel 6 , Christophe Hirtz 2 , Sylvain Lehmann 2 , Milena Quaglia 1
Analyst ( IF 3.6 ) Pub Date : 2024-07-23 , DOI: 10.1039/d4an00634h Leran Zhang 1 , Eva Illes-Toth 1 , Adam Cryar 1 , Giles Drinkwater 1 , Lucia Di Vagno 1 , Marie-Laure Pons 2 , Julia Mateyka 1 , Bryan McCullough 1 , Eli Achtar 1 , Cailean Clarkson 1 , Laura Göschel 3, 4 , Peter Körtvélyessy 3, 5 , Chris Mussell 1 , Christopher J Hopley 1 , Agnes Flöel 6 , Christophe Hirtz 2 , Sylvain Lehmann 2 , Milena Quaglia 1
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α-synuclein aggregation is an important hallmark of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease (PD) and Lewy body dementia. α-synuclein has been increasingly used as a diagnostic biomarker in PD and other synucleinopathies. Current clinical assays rely on antibody-based immunoassays to detect α-synuclein, which possess high sensitivity, afford high throughput and require small sample volumes. The utility of these assays, however, may be compounded by the specificity, selectivity and batch-to-batch heterogeneity of the antibody used, which can lead to deviations in the total amount of the protein measured when comparing results among different laboratories. Similarly, current mass spectrometry-based quantification methods for α-synuclein lack well-defined, value assigned calibrators to ensure comparability of measurements. Therefore, there is still an unmet need for the standardisation of clinical measurements for α-synuclein that can be achieved by the development of reference measurement procedures (RMPs) utilising calibrators traceable to the SI (International System of Units). Here, we report a candidate RMP for α-synuclein, using an SI traceable primary calibrator and an isotope dilution mass spectrometry (IDMS) approach to address this need. The gravimetrically prepared primary calibrator was traceably quantified utilising a combination of amino acid analysis (AAA) and quantitative nuclear magnetic resonance (qNMR) for value assignment. An optimised targeted sample clean-up procedure involving a non-denaturing Lys-C digestion and solid-phase extraction strategy was devised, followed by the development of a targeted multiple reaction monitoring (MRM) method for the quantification of α-synuclein in cerebrospinal fluid (CSF). This candidate RMP was then deployed for the sensitive detection and accurate quantification of multiple proteotypic α-synuclein peptides in patient derived CSF samples. The LC-MS based results were subsequently compared to immunoassay data to assess the overall performance of our approach. The development and adoption of this candidate RMP, along with the availability of the SI traceable primary calibrator will allow for reliable quantifications of α-synuclein in CSF by an LC-MS based assay. The RMP will potentially contribute towards the standardisation of this important biomarker and may lead to future interlaboratory comparisons.
中文翻译：
使用 SI 可追踪初级校准器和多反应监测对脑脊液中 α-突触核蛋白进行定量的候选参考测量程序
α-突触核蛋白聚集是帕金森病（PD）和路易体痴呆等神经退行性疾病的重要标志。 α-突触核蛋白已越来越多地用作 PD 和其他突触核蛋白病的诊断生物标志物。目前的临床检测依靠基于抗体的免疫检测来检测α-突触核蛋白，其具有高灵敏度、高通量且需要小样本量。然而，这些测定的实用性可能会因所用抗体的特异性、选择性和批次间异质性而变得复杂，这可能导致在比较不同实验室之间的结果时测量的蛋白质总量出现偏差。同样，当前基于质谱的 α-突触核蛋白定量方法缺乏明确定义的、指定值的校准器来确保测量结果的可比性。因此，α-突触核蛋白临床测量标准化的需求仍然未得到满足，这可以通过利用可追溯至 SI（国际单位制）的校准品开发参考测量程序 (RMP) 来实现。在这里，我们报告了 α-突触核蛋白的候选 RMP，使用 SI 可追踪初级校准器和同位素稀释质谱 (IDMS) 方法来满足这一需求。利用氨基酸分析 (AAA) 和定量核磁共振 (qNMR) 的组合对重量法制备的初级校准物进行可追踪定量，以进行赋值。设计了一种优化的靶向样品净化程序，涉及非变性 Lys-C 消化和固相萃取策略，随后开发了一种用于定量脑脊液中 α-突触核蛋白的靶向多反应监测 (MRM) 方法（脑脊液）。 然后将该候选 RMP 用于对患者脑脊液样本中的多种蛋白型 α-突触核蛋白肽进行灵敏检测和准确定量。随后将基于 LC-MS 的结果与免疫测定数据进行比较，以评估我们方法的整体性能。该候选 RMP 的开发和采用，以及 SI 可追踪初级校准器的可用性，将允许通过基于 LC-MS 的测定对 CSF 中的 α-突触核蛋白进行可靠的定量。 RMP 将有可能有助于这一重要生物标志物的标准化，并可能导致未来的实验室间比较。
更新日期：2024-07-23
中文翻译：
使用 SI 可追踪初级校准器和多反应监测对脑脊液中 α-突触核蛋白进行定量的候选参考测量程序
α-突触核蛋白聚集是帕金森病（PD）和路易体痴呆等神经退行性疾病的重要标志。 α-突触核蛋白已越来越多地用作 PD 和其他突触核蛋白病的诊断生物标志物。目前的临床检测依靠基于抗体的免疫检测来检测α-突触核蛋白，其具有高灵敏度、高通量且需要小样本量。然而，这些测定的实用性可能会因所用抗体的特异性、选择性和批次间异质性而变得复杂，这可能导致在比较不同实验室之间的结果时测量的蛋白质总量出现偏差。同样，当前基于质谱的 α-突触核蛋白定量方法缺乏明确定义的、指定值的校准器来确保测量结果的可比性。因此，α-突触核蛋白临床测量标准化的需求仍然未得到满足，这可以通过利用可追溯至 SI（国际单位制）的校准品开发参考测量程序 (RMP) 来实现。在这里，我们报告了 α-突触核蛋白的候选 RMP，使用 SI 可追踪初级校准器和同位素稀释质谱 (IDMS) 方法来满足这一需求。利用氨基酸分析 (AAA) 和定量核磁共振 (qNMR) 的组合对重量法制备的初级校准物进行可追踪定量，以进行赋值。设计了一种优化的靶向样品净化程序，涉及非变性 Lys-C 消化和固相萃取策略，随后开发了一种用于定量脑脊液中 α-突触核蛋白的靶向多反应监测 (MRM) 方法（脑脊液）。 然后将该候选 RMP 用于对患者脑脊液样本中的多种蛋白型 α-突触核蛋白肽进行灵敏检测和准确定量。随后将基于 LC-MS 的结果与免疫测定数据进行比较，以评估我们方法的整体性能。该候选 RMP 的开发和采用，以及 SI 可追踪初级校准器的可用性，将允许通过基于 LC-MS 的测定对 CSF 中的 α-突触核蛋白进行可靠的定量。 RMP 将有可能有助于这一重要生物标志物的标准化，并可能导致未来的实验室间比较。
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