OMEGA RNA (ωRNA)-guided endonuclease IscB, the evolutionary ancestor of Cas9, is an attractive system for in vivo genome editing because of its compact size and mechanistic resemblance to Cas9. However, wild-type IscB–ωRNA systems show limited activity in human cells. Here we report enhanced OgeuIscB, which, with eight amino acid substitutions, displayed a fourfold increase in in vitro DNA-binding affinity and a 30.4-fold improvement in insertion–deletion (indel) formation efficiency in human cells. Paired with structure-guided ωRNA engineering, the enhanced OgeuIscB–ωRNA systems efficiently edited the human genome across 26 target sites, attaining up to 87.3% indel and 62.2% base-editing frequencies. Both wild-type and engineered OgeuIscB–ωRNA showed moderate fidelity in editing the human genome, with off-target profiles revealing key determinants of target selection including an NARR target-adjacent motif (TAM) and the TAM-proximal 14 nucleotides in the R-loop. Collectively, our engineered OgeuIscB–ωRNA systems are programmable, potent and sufficiently specific for human genome editing.

OMEGA RNA （ωRNA） 引导的核酸内切酶 IscB 是 Cas9 的进化祖先，由于其紧凑的尺寸和与 Cas9 的机制相似性，因此是一种有吸引力的体内基因组编辑系统。然而，野生型 IscB–ωRNA 系统在人类细胞中的活性有限。在这里，我们报告了增强的 OgeuIscB，它具有 8 个氨基酸取代，在人类细胞中体外 DNA 结合亲和力增加了 4 倍，插入-缺失 （indel） 形成效率提高了 30.4 倍。与结构引导的 ωRNA 工程配合使用，增强的 OgeuIscB-ωRNA 系统有效地编辑了 26 个靶位点的人类基因组，实现了高达 87.3% 的插入缺失和 62.2% 的碱基编辑频率。野生型和工程化 OgeuIscB-ωRNA 在编辑人类基因组时均显示出中等保真度，脱靶谱揭示了靶标选择的关键决定因素，包括 NARR 靶标相邻基序 （TAM） 和 R 环中的 TAM 近端 14 个核苷酸。总的来说，我们设计的 OgeuIscB–ωRNA 系统是可编程的、有效的，并且对人类基因组编辑具有足够的特异性。