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Seamless knockins in Drosophila via CRISPR-triggered single-strand annealing
Developmental Cell ( IF 10.7 ) Pub Date : 2024-07-05 , DOI: 10.1016/j.devcel.2024.06.004 Gustavo Aguilar 1 , Milena Bauer 1 , M Alessandra Vigano 1 , Sophie T Schnider 1 , Lukas Brügger 1 , Carlos Jiménez-Jiménez 2 , Isabel Guerrero 2 , Markus Affolter 1
Developmental Cell ( IF 10.7 ) Pub Date : 2024-07-05 , DOI: 10.1016/j.devcel.2024.06.004 Gustavo Aguilar 1 , Milena Bauer 1 , M Alessandra Vigano 1 , Sophie T Schnider 1 , Lukas Brügger 1 , Carlos Jiménez-Jiménez 2 , Isabel Guerrero 2 , Markus Affolter 1
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CRISPR-Cas greatly facilitated the integration of exogenous sequences into specific loci. However, knockin generation in multicellular animals remains challenging, partially due to the complexity of insertion screening. Here, we describe SEED/Harvest, a method to generate knockins in Drosophila , based on CRISPR-Cas and the single-strand annealing (SSA) repair pathway. In SEED (from “scarless editing by element deletion”), a switchable cassette is first integrated into the target locus. In a subsequent CRISPR-triggered repair event, resolved by SSA, the cassette is seamlessly removed. Germline excision of SEED cassettes allows for fast and robust knockin generation of both fluorescent proteins and short protein tags in tandem. Tissue-specific expression of Cas9 results in somatic cassette excision, conferring spatiotemporal control of protein labeling and the conditional rescue of mutants. Finally, to achieve conditional protein labeling and manipulation of short tag knockins, we developed a genetic toolbox by functionalizing the ALFA nanobody.
中文翻译：
通过 CRISPR 触发的单链退火在果蝇中无缝敲除
CRISPR-Cas 极大地促进了外源序列与特定基因座的整合。然而，多细胞动物的敲入产生仍然具有挑战性，部分原因是插入筛选的复杂性。在这里，我们描述了 SEED/Harvest，这是一种基于 CRISPR-Cas 和单链退火 （SSA） 修复途径在果蝇中产生敲入的方法。在 SEED 中（来自“通过元素删除进行无痕编辑”），首先将可切换的暗盒集成到目标基因座中。在随后的 CRISPR 触发的修复事件中，由 SSA 解决，包埋盒被无缝移除。SEED 盒的种系切除可同时快速、稳健地产生荧光蛋白和短蛋白标签。Cas9 的组织特异性表达导致体细胞盒切除，赋予蛋白质标记的时空控制和突变体的条件拯救。最后，为了实现条件性蛋白质标记和短标签敲入的操作，我们通过功能化 ALFA 纳米抗体开发了一个遗传工具箱。
更新日期：2024-07-05
中文翻译：
通过 CRISPR 触发的单链退火在果蝇中无缝敲除
CRISPR-Cas 极大地促进了外源序列与特定基因座的整合。然而，多细胞动物的敲入产生仍然具有挑战性，部分原因是插入筛选的复杂性。在这里，我们描述了 SEED/Harvest，这是一种基于 CRISPR-Cas 和单链退火 （SSA） 修复途径在果蝇中产生敲入的方法。在 SEED 中（来自“通过元素删除进行无痕编辑”），首先将可切换的暗盒集成到目标基因座中。在随后的 CRISPR 触发的修复事件中，由 SSA 解决，包埋盒被无缝移除。SEED 盒的种系切除可同时快速、稳健地产生荧光蛋白和短蛋白标签。Cas9 的组织特异性表达导致体细胞盒切除，赋予蛋白质标记的时空控制和突变体的条件拯救。最后，为了实现条件性蛋白质标记和短标签敲入的操作，我们通过功能化 ALFA 纳米抗体开发了一个遗传工具箱。
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