Nature Communications ( IF 14.7 ) Pub Date : 2023-03-30 , DOI: 10.1038/s41467-023-37507-8 Jaesuk Lee 1, 2 , Kayeong Lim 1, 3 , Annie Kim 1 , Young Geun Mok 1, 4 , Eugene Chung 1, 2 , Sung-Ik Cho 1, 2, 5 , Ji Min Lee 1, 2 , Jin-Soo Kim 1, 6
与产生 DNA 双链断裂 (DSB) 的 CRISPR-Cas9 核酸酶不同,Cas9 切口酶 (nCas9s) 是通过替换化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 的两个核酸酶结构域之一中的关键催化氨基酸残基而产生的,产生缺口或单链断裂。两种 SpCas9 变体,即 nCas9 (D10A) 和 nCas9 (H840A),分别切割目标(引导 RNA 配对)和非目标 DNA 链,被广泛用于各种目的,包括配对切口、同源定向修复、基础编辑和主要编辑。为了确定由这些切口酶引起的脱靶切口,我们执行了 Digenome-seq,这是一种基于对用核酸酶或感兴趣的切口酶处理的基因组 DNA 进行全基因组测序的方法,并发现 nCas9 (H840A) 而不是 nCas9 (D10A) 可以切割两条链,产生不需要的 DSB,尽管效率低于野生型 Cas9。为了进一步灭活 HNH 核酸酶结构域,我们将额外的突变整合到 nCas9 (H840A) 中。双突变体 nCas9 (H840A + N863A) 在体外不表现出 DSB 诱导行为,并且无论是单独使用还是与 M-MLV 逆转录酶(主要编辑器、PE2 或 PE3)融合,都会诱导较低频率的不需要的插入缺失,与 nCas9 (H840A) 相比,由 DSB 的易错修复引起。当纳入 prime editor 并与工程化的 pegRNA (ePE3) 一起使用时,我们发现 nCas9 变体 (H840A + N854A) 显着增加了正确编辑的频率,但没有不需要的插入缺失,与 nCas9 (H840A) 相比,产生了最高纯度的编辑结果). 双突变体 nCas9 (H840A + N863A) 在体外不表现出 DSB 诱导行为,并且无论是单独使用还是与 M-MLV 逆转录酶(主要编辑器、PE2 或 PE3)融合,都会诱导较低频率的不需要的插入缺失,与 nCas9 (H840A) 相比,由 DSB 的易错修复引起。当纳入 prime editor 并与工程化的 pegRNA (ePE3) 一起使用时,我们发现 nCas9 变体 (H840A + N854A) 显着增加了正确编辑的频率,但没有不需要的插入缺失,与 nCas9 (H840A) 相比,产生了最高纯度的编辑结果). 双突变体 nCas9 (H840A + N863A) 在体外不表现出 DSB 诱导行为,并且无论是单独使用还是与 M-MLV 逆转录酶(主要编辑器、PE2 或 PE3)融合,都会诱导较低频率的不需要的插入缺失,与 nCas9 (H840A) 相比,由 DSB 的易错修复引起。当纳入 prime editor 并与工程化的 pegRNA (ePE3) 一起使用时,我们发现 nCas9 变体 (H840A + N854A) 显着增加了正确编辑的频率,但没有不需要的插入缺失,与 nCas9 (H840A) 相比,产生了最高纯度的编辑结果).
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