As a major epigenetic modification, DNA methylation participates in diverse cellular functions and emerges as a promising biomarker for disease diagnosis and monitoring. Herein, we developed a methylation-sensitive transcription-enhanced single-molecule biosensor to detect DNA methylation in human cells and tissues. In this biosensor, a rationally designed transcription machine is split into two parts including a promoter sequence (probe-P) for initiating transcription and a template sequence (probe-T) for RNA synthesis. The presence of specific DNA methylation leads to the formation of full-length transcription machine through sequence-specific ligation of probe-P and probe-T, initiating the synthesis of abundant ssRNA transcripts. The resultant ssRNAs can activate CRISPR/Cas12a to catalyze cyclic cleavage of fluorophore- and quencher-dual labeled signal probes, resulting in the recovery of the fluorophore signal that can be quantified by single-molecule detection. Taking advantages of the high-fidelity ligation of split transcription machine and the high efficiency of transcription- and CRISPR/Cas12a cleavage-mediated dual signal amplification, this single-molecule biosensor achieves a low detection limit of 337 aM and high selectivity. Moreover, it can distinguish 0.01% methylation level, and even accurately detect genomic DNA methylation in single cell and clinical samples, providing a powerful tool for epigenetic researches and clinical diagnostics.

作为一种主要的表观遗传修饰，DNA 甲基化参与多种细胞功能，并成为疾病诊断和监测的有前途的生物标志物。在此，我们开发了一种甲基化敏感的转录增强型单分子生物传感器来检测人体细胞和组织中的 DNA 甲基化。在这个生物传感器中，一个合理设计的转录机器被分成两部分，包括启动转录的启动子序列（probe-P）和用于 RNA 合成的模板序列（probe-T）。特定 DNA 甲基化的存在导致通过探针-P 和探针-T 的序列特异性连接形成全长转录机器，从而启动丰富的 ssRNA 转录本的合成。由此产生的 ssRNA 可以激活 CRISPR/Cas12a 以催化荧光团和猝灭剂双标记信号探针的循环裂解，从而恢复荧光团信号，该荧光团信号可以通过单分子检测进行量化。利用分裂转录机的高保真连接和转录和 CRISPR/Cas12a 切割介导的双信号放大的高效性，这种单分子生物传感器实现了 337 aM 的低检测限和高选择性。而且，它可以区分0.01%的甲基化水平，甚至可以准确检测单细胞和临床样本中的基因组DNA甲基化，为表观遗传学研究和临床诊断提供有力工具。利用分裂转录机的高保真连接和转录和 CRISPR/Cas12a 切割介导的双信号放大的高效性，这种单分子生物传感器实现了 337 aM 的低检测限和高选择性。而且，它可以区分0.01%的甲基化水平，甚至可以准确检测单细胞和临床样本中的基因组DNA甲基化，为表观遗传学研究和临床诊断提供有力工具。利用分裂转录机的高保真连接和转录和 CRISPR/Cas12a 切割介导的双信号放大的高效性，这种单分子生物传感器实现了 337 aM 的低检测限和高选择性。而且，它可以区分0.01%的甲基化水平，甚至可以准确检测单细胞和临床样本中的基因组DNA甲基化，为表观遗传学研究和临床诊断提供有力工具。