底物亲和力与催化效率：tRNA 核苷酸转移酶的祖先序列重建解决了一个酶难题,Molecular Biology and Evolution

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底物亲和力与催化效率：tRNA 核苷酸转移酶的祖先序列重建解决了一个酶难题
Molecular Biology and Evolution ( IF 11.0 ) Pub Date : 2022-11-21 , DOI: 10.1093/molbev/msac250
Martina Hager ₁ , Marie-Theres Pöhler ₁ , Franziska Reinhardt _{2,

3} , Karolin Wellner ₁ , Jessica Hübner ₂ , Heike Betat ₁ , Sonja Prohaska _{2,

3,

4,

5} , Mario Mörl ₁

Affiliation

在 tRNA 成熟过程中，tRNA 核苷酸转移酶添加 CCA 是一种独特且高度准确的反应。虽然核苷酸选择和聚合的机制已广为人知，但为什么细菌和真核酶在有效催化 CCA 加成时表现出意想不到的低 tRNA 底物亲和力仍然是一个谜。要深入了解这种高保真 RNA 合成的演变，祖先酶的重建和表征是一种多功能工具。在这里，我们研究了来自 Gammaproteobacteria 的 20 亿年前的 CCA 添加酶的重建候选物，并将其与大肠杆菌的相应现代酶进行比较。我们表明祖先候选物催化无错误的 CCA 添加，但与现存酶相比具有更高的 tRNA 亲和力。这种增加的底物结合的结果是增强的逆反应，其中酶从成熟的 tRNA 中去除 CCA 末端。结果，祖先候选物在体外和体内表现出较低的催化效率。此外，有效的 tRNA 相互作用导致持续聚合，而现存的酶以分配方式催化核苷酸添加。因此，现代酶通过降低与 tRNA 的结合亲和力来提高聚合效率，从而由于减少的逆反应而有效地促进了 CCA 的合成。因此，令人费解且乍一看矛盾且有害的弱底物相互作用代表了 CCA 添加酶进化过程中明显的活性增强。酶从成熟 tRNA 中去除 CCA 末端。结果，祖先候选物在体外和体内表现出较低的催化效率。此外，有效的 tRNA 相互作用导致持续聚合，而现存的酶以分配方式催化核苷酸添加。因此，现代酶通过降低与 tRNA 的结合亲和力来提高聚合效率，从而由于减少的逆反应而有效地促进了 CCA 的合成。因此，令人费解且乍一看矛盾且有害的弱底物相互作用代表了 CCA 添加酶进化过程中明显的活性增强。酶从成熟 tRNA 中去除 CCA 末端。结果，祖先候选物在体外和体内表现出较低的催化效率。此外，有效的 tRNA 相互作用导致持续聚合，而现存的酶以分配方式催化核苷酸添加。因此，现代酶通过降低与 tRNA 的结合亲和力来提高聚合效率，从而由于减少的逆反应而有效地促进了 CCA 的合成。因此，令人费解且乍一看矛盾且有害的弱底物相互作用代表了 CCA 添加酶进化过程中明显的活性增强。有效的 tRNA 相互作用导致进行性聚合，而现存的酶以分配方式催化核苷酸添加。因此，现代酶通过降低与 tRNA 的结合亲和力来提高聚合效率，从而由于减少的逆反应而有效地促进了 CCA 的合成。因此，令人费解且乍一看矛盾且有害的弱底物相互作用代表了 CCA 添加酶进化过程中明显的活性增强。有效的 tRNA 相互作用导致进行性聚合，而现存的酶以分配方式催化核苷酸添加。因此，现代酶通过降低与 tRNA 的结合亲和力来提高聚合效率，从而由于减少的逆反应而有效地促进了 CCA 的合成。因此，令人费解且乍一看矛盾且有害的弱底物相互作用代表了 CCA 添加酶进化过程中明显的活性增强。

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Substrate affinity versus catalytic efficiency: Ancestral sequence reconstruction of tRNA nucleotidyltransferases solves an enzyme puzzle

In tRNA maturation, CCA-addition by tRNA nucleotidyltransferase is a unique and highly accurate reaction. While the mechanism of nucleotide selection and polymerization is well understood, it remains a mystery why bacterial and eukaryotic enzymes exhibit an unexpected and surprisingly low tRNA substrate affinity while they efficiently catalyze the CCA-addition. To get insights into the evolution of this high-fidelity RNA synthesis, reconstruction and characterization of ancestral enzymes is a versatile tool. Here, we investigate a reconstructed candidate of a 2 billion years old CCA-adding enzyme from Gammaproteobacteria and compare it to the corresponding modern enzyme of Escherichia coli. We show that the ancestral candidate catalyzes an error-free CCA-addition, but has a much higher tRNA affinity compared to the extant enzyme. The consequence of this increased substrate binding is an enhanced reverse reaction, where the enzyme removes the CCA end from the mature tRNA. As a result, the ancestral candidate exhibits a lower catalytic efficiency in vitro as well as in vivo. Furthermore, the efficient tRNA interaction leads to a processive polymerization, while the extant enzyme catalyzes nucleotide addition in a distributive way. Thus, the modern enzymes increased their polymerization efficiency by lowering the binding affinity to tRNA, so that CCA synthesis is efficiently promoted due to a reduced reverse reaction. Hence, the puzzling and at a first glance contradicting and detrimental weak substrate interaction represents a distinct activity enhancement in the evolution of CCA-adding enzymes.

更新日期：2022-11-21

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