当前位置：
X-MOL 学术
›
Dev. Growth Differ.
›
论文详情
Our official English website, www.x-mol.net, welcomes your
feedback! (Note: you will need to create a separate account there.)
P-body dynamics revealed by DDX6 protein knockdown via the auxin-inducible degron system
Development, Growth & Differentiation ( IF 1.7 ) Pub Date : 2022-11-10 , DOI: 10.1111/dgd.12821 Adithya Dhamodharan 1 , Hajime Okada 2 , Masafumi Muraoka 2 , Danelle Wright 2 , Akemi Okubo 2 , Yumiko Saga 2, 3, 4
Development, Growth & Differentiation ( IF 1.7 ) Pub Date : 2022-11-10 , DOI: 10.1111/dgd.12821 Adithya Dhamodharan 1 , Hajime Okada 2 , Masafumi Muraoka 2 , Danelle Wright 2 , Akemi Okubo 2 , Yumiko Saga 2, 3, 4
Affiliation
|
The transcriptome dynamically changes via several transcriptional and post-transcriptional mechanisms. RNA-binding proteins contribute to such mechanisms to regulate the cellular status. DDX6 is one such protein and a core component of processing bodies (P-bodies), membrane-less cytosolic substructures where RNA and proteins localize and are functionally regulated. Despite the importance of DDX6, owing to the lack of tightly controlled methods for protein knockdown, it was difficult to assess in high time resolution how its depletion exactly affects the P-body assembly structure. Therefore, we adopted an advanced protein degradation method, the auxin-induced degron (AID) system, to degrade DDX6 acutely in ES cells. By introducing AID-tagged DDX6 and the E3 ligase subunit of OsTIR1 into ES cells, we successfully degraded DDX6 following auxin analog (indole-3-acetic acid, IAA) treatment. The degradation rate of DDX6 was slower than that of the cytosolic reporter protein EGFP but was enhanced by increasing the OsTIR1 dosage. Lastly, we confirmed that a substantial portion of P-bodies disappears around the time of 1 hr after IAA addition consistent with DDX6 depletion detected by western blot. In accordance with this, we detected transcriptome changes by 6 hr after IAA treatment. Therefore, we demonstrated the applicability of the AID method to gain insight into the function of P-bodies and their protein components.
中文翻译：
通过生长素诱导的 degron 系统通过 DDX6 蛋白敲低揭示的 P 体动力学
转录组通过多种转录和转录后机制动态变化。RNA 结合蛋白有助于调节细胞状态的这种机制。DDX6 是一种这样的蛋白质，也是加工体 (P-bodies) 的核心成分，无膜细胞溶质亚结构，RNA 和蛋白质在其中定位并在功能上受到调节。尽管 DDX6 很重要，但由于缺乏严格控制的蛋白质敲低方法，很难以高时间分辨率评估其耗尽如何准确影响 P 体组装结构。因此，我们采用了一种先进的蛋白质降解方法，即生长素诱导的 degron (AID) 系统，以在 ES 细胞中快速降解 DDX6。通过将 AID 标记的 DDX6 和 OsTIR1 的 E3 连接酶亚基引入 ES 细胞，我们在生长素类似物（吲哚-3-乙酸，IAA）处理后成功降解了 DDX6。DDX6 的降解速率比细胞溶质报告蛋白 EGFP 慢，但通过增加 OsTIR1 剂量得到增强。最后，我们证实，在添加 IAA 后 1 小时左右，大部分 P 体消失，这与蛋白质印迹检测到的 DDX6 耗尽一致。据此，我们在 IAA 处理后 6 小时检测到转录组变化。因此，我们证明了 AID 方法在深入了解 P 体及其蛋白质成分的功能方面的适用性。我们证实，在添加 IAA 后 1 小时左右，大部分 P 体消失，这与蛋白质印迹检测到的 DDX6 耗尽一致。据此，我们在 IAA 处理后 6 小时检测到转录组变化。因此，我们证明了 AID 方法在深入了解 P 体及其蛋白质成分的功能方面的适用性。我们证实，在添加 IAA 后 1 小时左右，大部分 P 体消失，这与蛋白质印迹检测到的 DDX6 耗尽一致。据此，我们在 IAA 处理后 6 小时检测到转录组变化。因此，我们证明了 AID 方法在深入了解 P 体及其蛋白质成分的功能方面的适用性。
更新日期：2022-11-10
中文翻译：
通过生长素诱导的 degron 系统通过 DDX6 蛋白敲低揭示的 P 体动力学
转录组通过多种转录和转录后机制动态变化。RNA 结合蛋白有助于调节细胞状态的这种机制。DDX6 是一种这样的蛋白质，也是加工体 (P-bodies) 的核心成分，无膜细胞溶质亚结构，RNA 和蛋白质在其中定位并在功能上受到调节。尽管 DDX6 很重要，但由于缺乏严格控制的蛋白质敲低方法，很难以高时间分辨率评估其耗尽如何准确影响 P 体组装结构。因此，我们采用了一种先进的蛋白质降解方法，即生长素诱导的 degron (AID) 系统，以在 ES 细胞中快速降解 DDX6。通过将 AID 标记的 DDX6 和 OsTIR1 的 E3 连接酶亚基引入 ES 细胞，我们在生长素类似物（吲哚-3-乙酸，IAA）处理后成功降解了 DDX6。DDX6 的降解速率比细胞溶质报告蛋白 EGFP 慢，但通过增加 OsTIR1 剂量得到增强。最后，我们证实，在添加 IAA 后 1 小时左右，大部分 P 体消失，这与蛋白质印迹检测到的 DDX6 耗尽一致。据此，我们在 IAA 处理后 6 小时检测到转录组变化。因此，我们证明了 AID 方法在深入了解 P 体及其蛋白质成分的功能方面的适用性。我们证实，在添加 IAA 后 1 小时左右，大部分 P 体消失，这与蛋白质印迹检测到的 DDX6 耗尽一致。据此，我们在 IAA 处理后 6 小时检测到转录组变化。因此，我们证明了 AID 方法在深入了解 P 体及其蛋白质成分的功能方面的适用性。我们证实，在添加 IAA 后 1 小时左右，大部分 P 体消失，这与蛋白质印迹检测到的 DDX6 耗尽一致。据此，我们在 IAA 处理后 6 小时检测到转录组变化。因此，我们证明了 AID 方法在深入了解 P 体及其蛋白质成分的功能方面的适用性。
京公网安备 11010802027423号