<br>针对单核苷酸嘧啶 PAM 的紧凑型 Cas9 变体的高通量连续进化,Nature Biotechnology

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针对单核苷酸嘧啶 PAM 的紧凑型 Cas9 变体的高通量连续进化
Nature Biotechnology ( IF 33.1 ) Pub Date : 2022-09-08 , DOI: 10.1038/s41587-022-01410-2
Tony P Huang _{1,

2,

3} , Zachary J Heins _{4,

5} , Shannon M Miller _{1,

2,

3} , Brandon G Wong _{4,

5} , Pallavi A Balivada _{4,

5} , Tina Wang _{1,

2,

3,

6} , Ahmad S Khalil _{4,

5,

7} , David R Liu _{1,

2,

3}

Affiliation

尽管具有多种原型间隔子相邻基序 (PAM) 兼容性的 Cas9 变体可用，但高活性 Cas9 蛋白仍然无法访问一些基因组位点，尤其是那些富含嘧啶的 PAM 序列。此外，通过工程拓宽 PAM 序列兼容性可以增加脱靶活性。通过定向进化，我们生成了四种 Cas9 变体，它们共同能够靶向人类基因组中大多数富含嘧啶的 PAM 序列。利用噬菌体辅助非连续进化和 eVOLVER 支持的噬菌体辅助连续进化，我们将 Nme2Cas9（一种紧凑型 Cas9 变体）进化为识别单核苷酸嘧啶-PAM 序列的变体。我们开发了一种通用选择策略，需要使用完全指定的目标原型间隔区和 PAM 进行功能编辑。我们应用这种选择来进化高活性变体 eNme2-T.1、eNme2-T.2、eNme2-C 和 eNme2-C.NR。变体 eNme2-T.1 和 eNme2-T.2 提供对 N ₄ TN PAM 序列的访问，其编辑效率与现有变体相当，而 eNme2-C 和 eNme2-C.NR 提供限制较少的 PAM 要求，在多种人类细胞类型，并且 N ₄ CN PAM 序列的脱靶活性较低。

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更新日期：2022-09-09

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