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针对单核苷酸嘧啶 PAM 的紧凑型 Cas9 变体的高通量连续进化
Nature Biotechnology ( IF 33.1 ) Pub Date : 2022-09-08 , DOI: 10.1038/s41587-022-01410-2 Tony P Huang 1, 2, 3 , Zachary J Heins 4, 5 , Shannon M Miller 1, 2, 3 , Brandon G Wong 4, 5 , Pallavi A Balivada 4, 5 , Tina Wang 1, 2, 3, 6 , Ahmad S Khalil 4, 5, 7 , David R Liu 1, 2, 3
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尽管具有多种原型间隔子相邻基序 (PAM) 兼容性的 Cas9 变体可用,但高活性 Cas9 蛋白仍然无法访问一些基因组位点,尤其是那些富含嘧啶的 PAM 序列。此外,通过工程拓宽 PAM 序列兼容性可以增加脱靶活性。通过定向进化,我们生成了四种 Cas9 变体,它们共同能够靶向人类基因组中大多数富含嘧啶的 PAM 序列。利用噬菌体辅助非连续进化和 eVOLVER 支持的噬菌体辅助连续进化,我们将 Nme2Cas9(一种紧凑型 Cas9 变体)进化为识别单核苷酸嘧啶-PAM 序列的变体。我们开发了一种通用选择策略,需要使用完全指定的目标原型间隔区和 PAM 进行功能编辑。我们应用这种选择来进化高活性变体 eNme2-T.1、eNme2-T.2、eNme2-C 和 eNme2-C.NR。变体 eNme2-T.1 和 eNme2-T.2 提供对 N 4 TN PAM 序列的访问,其编辑效率与现有变体相当,而 eNme2-C 和 eNme2-C.NR 提供限制较少的 PAM 要求,在多种人类细胞类型,并且 N 4 CN PAM 序列的脱靶活性较低。
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