利用 CRISPR/Cas12a 系统中的多重 crRNA 实现 ASFV 检测的无扩增 DNA 诊断平台,Analytical Chemistry

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利用 CRISPR/Cas12a 系统中的多重 crRNA 实现 ASFV 检测的无扩增 DNA 诊断平台
Analytical Chemistry ( IF 6.7 ) Pub Date : 2022-07-20 , DOI: 10.1021/acs.analchem.2c01588
Muchu Zeng _{1,

2,

3} , Yuqing Ke ₁ , Zhiyi Zhuang ₄ , Chao Qin ₅ , Lai Yan Li ₆ , Gaoyuan Sheng ₁ , Zhuoru Li ₁ , He Meng ₅ , Xianting Ding _{1,

3}

Affiliation

CRISPR 相关 (Cas) 蛋白系统已越来越多地纳入核酸诊断。CRISPR/Cas12a在被crRNA引导至目标双链DNA（dsDNA）后，可以切割单链DNA（ssDNA），使其成为dsDNA检测的特异性工具。在核酸预扩增的辅助下，CRISPR/Cas12a 能够在阿托摩尔水平上进行 dsDNA 检测。然而，在 CRISPR/Cas12a 中这种强制预扩增还伴随着将预扩增产物转移到 CRISPR/Cas12a 系统中的额外步骤，这不仅繁琐耗时，而且还存在交叉污染的风险。在这里，我们展示了一种多重 crRNA 策略来增强 CRISPR/Cas12a 系统的灵敏度，而无需任何预扩增。这种多重crRNA策略利用crRNA的多个序列，这些序列靶向同一CRISPR/Cas12a系统中同一dsDNA底物的不同区域。因此，检测信号在没有放大的情况下被累积，这增加了传统的检测限。为了应用演示，以非洲猪瘟病毒 (ASFV) 的 B646L 基因为例，它是一种 dsDNA 病毒。多重crRNA系统的检测限可以在不放大的情况下提高到~1皮摩尔（pM），比传统的单crRNA系统强~64倍。本研究中提出的多重 crRNA 系统经过轻微修改，可以推广到其他生物传感设置，其中预放大不容易获得。检测信号在没有放大的情况下累积，这增加了传统的检测限。为了应用演示，以非洲猪瘟病毒 (ASFV) 的 B646L 基因为例，它是一种 dsDNA 病毒。多重crRNA系统的检测限可以在不放大的情况下提高到~1皮摩尔（pM），比传统的单crRNA系统强~64倍。本研究中提出的多重 crRNA 系统经过轻微修改，可以推广到其他生物传感设置，其中预放大不容易获得。检测信号在没有放大的情况下累积，这增加了传统的检测限。为了应用演示，以非洲猪瘟病毒 (ASFV) 的 B646L 基因为例，它是一种 dsDNA 病毒。多重crRNA系统的检测限可以在不放大的情况下提高到~1皮摩尔（pM），比传统的单crRNA系统强~64倍。本研究中提出的多重 crRNA 系统经过轻微修改，可以推广到其他生物传感设置，其中预放大不容易获得。多重crRNA系统的检测限可以在不放大的情况下提高到~1皮摩尔（pM），比传统的单crRNA系统强~64倍。本研究中提出的多重 crRNA 系统经过轻微修改，可以推广到其他生物传感设置，其中预放大不容易获得。多重crRNA系统的检测限可以在不放大的情况下提高到~1皮摩尔（pM），比传统的单crRNA系统强~64倍。本研究中提出的多重 crRNA 系统经过轻微修改，可以推广到其他生物传感设置，其中预放大不容易获得。

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Harnessing Multiplex crRNA in the CRISPR/Cas12a System Enables an Amplification-Free DNA Diagnostic Platform for ASFV Detection

CRISPR-associated (Cas) protein systems have been increasingly incorporated in nucleic-acid diagnosis. CRISPR/Cas12a can cleave single-stranded DNA (ssDNA) after being guided to the target double-stranded DNA (dsDNA) with crRNA, making it a specific tool for dsDNA detection. Assisted by nucleic acid preamplification, CRISPR/Cas12a enables dsDNA detection at the attomolar level. However, such mandatory preamplification in CRISPR/Cas12a also accompanies the extra step of transferring preamplification products into the CRISPR/Cas12a system, which is not only cumbersome and time-consuming but also induces the risk of cross-contamination. Herein, we demonstrate a multiplex-crRNA strategy to enhance the sensitivity of the CRISPR/Cas12a system without any preamplification. This multiplex-crRNA strategy harnesses multiple sequences of crRNA which target different regions of the same dsDNA substrate in the same CRISPR/Cas12a system. Therefore, detection signals are accumulated without amplification, which augments the conventional detection limit. For application demonstration, the B646L gene from the African swine fever virus (ASFV), which is a dsDNA virus, is exemplified. The detection limit of the multiplex-crRNA system can be improved to ∼1 picomolar (pM) without amplification, which is ∼64 times stronger than the conventional single-crRNA system. The multiplex-crRNA system presented in this study, with slight modifications, can be generalized to other biosensing settings where preamplification is not readily available.

更新日期：2022-07-20

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