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Sculpting a Uniquely Reactive Cysteine Residue for Site-Specific Antibody Conjugation
Bioconjugate Chemistry ( IF 4.0 ) Pub Date : 2022-05-18 , DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.2c00146 Dobeen Hwang 1 , Napon Nilchan 2 , HaJeung Park 3 , Raktim N Roy 4 , William R Roush 2 , Christoph Rader 1
Bioconjugate Chemistry ( IF 4.0 ) Pub Date : 2022-05-18 , DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.2c00146 Dobeen Hwang 1 , Napon Nilchan 2 , HaJeung Park 3 , Raktim N Roy 4 , William R Roush 2 , Christoph Rader 1
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Catalytic antibody 38C2 and its humanized version h38C2 harbor a uniquely reactive lysine at the bottom of a 11 Å deep pocket that permits site-specific conjugation of β-diketone-, β-lactam-, and heteroaryl methylsulfonyl-functionalized small and large molecules. Various dual variable domain formats pair a tumor-targeting antibody with h38C2 to enable precise, fast, and stable assembly of antibody-drug conjugates (ADCs). Here, we expand the scope of this ADC assembly strategy by mutating h38C2’s reactive lysine to a cysteine. X-ray crystallography of this point mutant, h38C2_K99C, confirmed a deeply buried unpaired cysteine. Probing h38C2_K99C with maleimide, monobromomaleimide, and dibromomaleimide derivatives of a fluorophore revealed highly disparate conjugation efficiencies and stabilities. Dibromomaleimide emerged as a suitable electrophile for the precise, fast, efficient, and stable assembly of ADCs with the h38C2_K99C module. Mass spectrometry indicated the presence of a thio-monobromomaleimide linkage which was further supported by in silico docking studies. Using a dibromomaleimide derivative of the highly potent tubulin polymerization inhibitor monomethyl auristatin F, h38C2_K99C-based ADCs were found to be as potent as h38C2-based ADCs and afford a new assembly route for ADCs with single and dual payloads.
中文翻译：
为位点特异性抗体偶联雕刻独特的反应性半胱氨酸残基
催化抗体 38C2 及其人源化版本 h38C2 在 11 Å 深口袋底部具有独特的反应性赖氨酸，允许 β-二酮-、β-内酰胺-和杂芳基甲基磺酰基功能化的小分子和大分子进行位点特异性结合。多种双可变结构域形式将肿瘤靶向抗体与 h38C2 配对，以实现抗体药物偶联物 (ADC) 的精确、快速和稳定组装。在这里，我们通过将 h38C2 的反应性赖氨酸突变为半胱氨酸来扩展此 ADC 组装策略的范围。该点突变体 h38C2_K99C 的 X 射线晶体学证实了深埋的未配对半胱氨酸。用荧光团的马来酰亚胺、单溴马来酰亚胺和二溴马来酰亚胺衍生物探测 h38C2_K99C，揭示了高度不同的共轭效率和稳定性。二溴马来酰亚胺作为一种合适的亲电试剂出现，可用于精确、快速、高效和稳定地组装 ADC 与 h38C2_K99C 模块。质谱分析表明存在硫代-单溴马来酰亚胺连接，这进一步得到了计算机对接研究的支持。使用高效微管蛋白聚合抑制剂单甲基 auristatin F 的二溴马来酰亚胺衍生物，发现基于 h38C2_K99C 的 ADC 与基于 h38C2 的 ADC 一样有效，并为具有单一和双重有效载荷的 ADC 提供了新的组装途径。
更新日期：2022-05-18
中文翻译：
为位点特异性抗体偶联雕刻独特的反应性半胱氨酸残基
催化抗体 38C2 及其人源化版本 h38C2 在 11 Å 深口袋底部具有独特的反应性赖氨酸，允许 β-二酮-、β-内酰胺-和杂芳基甲基磺酰基功能化的小分子和大分子进行位点特异性结合。多种双可变结构域形式将肿瘤靶向抗体与 h38C2 配对，以实现抗体药物偶联物 (ADC) 的精确、快速和稳定组装。在这里，我们通过将 h38C2 的反应性赖氨酸突变为半胱氨酸来扩展此 ADC 组装策略的范围。该点突变体 h38C2_K99C 的 X 射线晶体学证实了深埋的未配对半胱氨酸。用荧光团的马来酰亚胺、单溴马来酰亚胺和二溴马来酰亚胺衍生物探测 h38C2_K99C，揭示了高度不同的共轭效率和稳定性。二溴马来酰亚胺作为一种合适的亲电试剂出现，可用于精确、快速、高效和稳定地组装 ADC 与 h38C2_K99C 模块。质谱分析表明存在硫代-单溴马来酰亚胺连接，这进一步得到了计算机对接研究的支持。使用高效微管蛋白聚合抑制剂单甲基 auristatin F 的二溴马来酰亚胺衍生物，发现基于 h38C2_K99C 的 ADC 与基于 h38C2 的 ADC 一样有效，并为具有单一和双重有效载荷的 ADC 提供了新的组装途径。
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