成瘾性骨髓瘤细胞消耗谷氨酰胺会抑制骨髓间充质基质细胞的成骨分化，从而限制天冬酰胺的可用性：骨髓瘤骨病的一种可能的新机制,Blood

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成瘾性骨髓瘤细胞消耗谷氨酰胺会抑制骨髓间充质基质细胞的成骨分化，从而限制天冬酰胺的可用性：骨髓瘤骨病的一种可能的新机制
Blood ( IF 21.0 ) Pub Date : 2019-11-13 , DOI: 10.1182/blood-2019-128034
Martina Chiu ₁ , Denise Toscani ₁ , Emanuela Vicario ₁ , Roberta Andreoli ₁ , Giuseppe Taurino ₁ , Valentina Marchica ₁ , Paola Storti ₁ , Massimiliano Bianchi ₁ , Ovidio Bussolati ₁ , Nicola Giuliani _{1,

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旨在维持其生长的癌细胞的代谢改变也可能影响肿瘤微环境的行为。我们小组最近证明，多发性骨髓瘤 (MM) 是一种高度谷氨酰胺 (Gln) 成瘾性肿瘤，它利用大量 Gln 通过谷氨酰胺酶 (GLS) 促进其代谢。出于这个原因，MM 细胞表现出增加的 Gln 摄取，主要是通过 ASCT2 转运蛋白。有趣的是，与冒烟型 MM (SMM) 和意义不确定的单克隆丙种球蛋白病 (MGUS) 相比，MM 患者的骨髓 (BM) 血浆 Gln 浓度较低（中位值 0.4 mM，而中位值 0.6 mM））。MM BM微环境的主要特征是抑制成骨细胞（OB）分化导致溶骨性骨病变的发展，MM的标志。最近，已经证明 Gln 代谢是维持小鼠模型中骨量形成所必需的，并且 GLS 抑制会降低人间充质基质细胞 (hMSCs) 的 OB 分化。然而，尚无关于 MM 细胞代谢对 OB 分化为 BM 所施加的 Gln 消耗的作用的信息。本研究已对该主题进行了调查。首先，将人 MM 细胞与 BM hMSCs 共培养，并用质谱 (MS) 评估 Gln 培养基浓度，证明 MM 诱导的氨基酸消耗。在 Gln 耗尽后，MSC 表现出对谷氨酰胺合成酶 (GS) 的持续诱导。相反，当在成骨培养基（D-MEM + 5% 胎牛血清，补充 2 mM Gln）中分化时，抗坏血酸和地塞米松），GS被抑制。相反，GLS（KGA 和 GAC 同种型）和 SLC38A2（集中 Gln 转运蛋白 SNAT2 的基因）被诱导。这些数据表明，hMSCs 在 OBs 中的分化与对细胞外 Gln 的依赖性增加有关。与该结论一致，SNAT2 的活性在未分化的 hMSC 中不存在，但在 OB 分化 14 天后可很好地检测到，此时总 Gln 摄取也增加。在相同条件下，显着诱导了 OB 分化标志物（RUNX2、COL1A1、ALPL 表达和 ALPL 活性或染色），但在低 Gln (0.4 mM) 培养基中孵育或存在 SNAT2 抑制剂 MeAIB 时，它们的表达减弱。在不含 Gln 的 D-MEM 中孵育抑制了 GLS 和 SLC38A2 的诱导以及 OB 分化，这通过补充非必需氨基酸 (NEAA) 得以恢复。在 NEAA 中，只有天冬酰胺 (Asn) 能够在没有 Gln 的情况下挽救 OB 分化。MS测定细胞内氨基酸表明OB分化与细胞Asn增加有关，而Gln、谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)无明显变化。天冬酰胺合成酶 (ASNS) 是一种解释 Asn 合成的 Gln 依赖性酶，也被发现在 hMSCs 的 OB 分化过程中被诱导。来自健康供体 (n=7) 和 MM 患者 (n=16) 的骨活检的原代 BM hMSCs 和 OBs 的基因表达谱表明 GLS、ASNS 和 SLC38A2 在 OBs 中表达更多，而 GS 基因 GLUL 的表达在来自健康供体的未分化 hMSC 中更高。总之，这些结果表明（1）hMSCs的OB分化是Gln依赖性的；(2) Gln 成瘾的 MM 细胞在 BM 微环境中造成的部分 Gln 消耗导致 hMSCs 成骨细胞分化受损；(3) 分化的障碍可能取决于源自 Gln 依赖性 ASNS 的细胞内 Asn 的有限可用性。这些结果支持MM细胞的Gln成瘾影响骨微环境导致OB分化抑制并因此导致MM骨病发展的证据。披露朱利安尼：杨森：研究经费。来自健康供体的未分化 hMSCs 较高。总之，这些结果表明（1）hMSCs的OB分化是Gln依赖性的；(2) Gln 成瘾的 MM 细胞在 BM 微环境中造成的部分 Gln 消耗导致 hMSCs 成骨细胞分化受损；(3) 分化的障碍可能取决于源自 Gln 依赖性 ASNS 的细胞内 Asn 的有限可用性。这些结果支持MM细胞的Gln成瘾影响骨微环境导致OB分化抑制并因此导致MM骨病发展的证据。披露朱利安尼：杨森：研究经费。来自健康供体的未分化 hMSCs 较高。总之，这些结果表明（1）hMSCs的OB分化是Gln依赖性的；(2) Gln 成瘾的 MM 细胞在 BM 微环境中造成的部分 Gln 消耗导致 hMSCs 成骨细胞分化受损；(3) 分化的障碍可能取决于源自 Gln 依赖性 ASNS 的细胞内 Asn 的有限可用性。这些结果支持MM细胞的Gln成瘾影响骨微环境导致OB分化抑制并因此导致MM骨病发展的证据。披露朱利安尼：杨森：研究经费。这些结果表明（1）hMSCs的OB分化是Gln依赖性的；(2) Gln 成瘾的 MM 细胞在 BM 微环境中造成的部分 Gln 消耗导致 hMSCs 成骨细胞分化受损；(3) 分化的障碍可能取决于源自 Gln 依赖性 ASNS 的细胞内 Asn 的有限可用性。这些结果支持MM细胞的Gln成瘾影响骨微环境导致OB分化抑制并因此导致MM骨病发展的证据。披露朱利安尼：杨森：研究经费。这些结果表明（1）hMSCs的OB分化是Gln依赖性的；(2) Gln 成瘾的 MM 细胞在 BM 微环境中造成的部分 Gln 消耗导致 hMSCs 成骨细胞分化受损；(3) 分化的障碍可能取决于源自 Gln 依赖性 ASNS 的细胞内 Asn 的有限可用性。这些结果支持MM细胞的Gln成瘾影响骨微环境导致OB分化抑制并因此导致MM骨病发展的证据。披露朱利安尼：杨森：研究经费。(3) 分化的障碍可能取决于源自 Gln 依赖性 ASNS 的细胞内 Asn 的有限可用性。这些结果支持MM细胞的Gln成瘾影响骨微环境导致OB分化抑制并因此导致MM骨病发展的证据。披露朱利安尼：杨森：研究经费。(3) 分化的障碍可能取决于源自 Gln 依赖性 ASNS 的细胞内 Asn 的有限可用性。这些结果支持MM细胞的Gln成瘾影响骨微环境导致OB分化抑制并因此导致MM骨病发展的证据。披露朱利安尼：杨森：研究经费。

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Glutamine Depletion By Addicted Myeloma Cells Inhibits Osteoblastic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Limiting Asparagine Availability: A Possible New Mechanism for Myeloma Bone Disease

Metabolic alterations of cancer cells, aimed at sustaining their growth, may also influence the behavior of the tumor microenvironment. Our group has recently demonstrated that multiple myeloma (MM) is a highly glutamine(Gln)-addicted tumor that utilize huge amounts of Gln to fuel its metabolism through the enzyme glutaminase (GLS). For this reason, MM cells exhibits increased Gln uptake, mainly through the ASCT2 transporter. Interestingly, lower bone marrow (BM) plasma Gln concentration (down to a median value of 0.4 mM vs. a median value of 0.6 mM) was found in MM patients as compared with smoldering MM (SMM) and Monoclonal Gammopathy of Uncertain Significance (MGUS). The main feature of MM BM microenvironment is the suppression of osteoblastic (OB) differentiation leading to the development of osteolytic bone lesions, the hallmark of MM. Most recently, it has been demonstrated that Gln metabolism is needed to sustain bone mass formation in murine models and that GLS inhibition decreases OB differentiation of human mesenchymal stromal cells (hMSCs). However, no information is yet available on the role of Gln depletion imposed by MM cell metabolism on OB differentiation into the BM. This topic has been investigated in the present study. Firstly, human MM cells were co-cultured with BM hMSCs, and Gln medium concentration was evaluated with mass spectrometry (MS), demonstrating a MM-induced depletion of the amino acid. Upon Gln depletion, MSC exhibited a sustained induction of Glutamine Synthetase (GS). On the contrary, when differentiated in osteogenic medium (D-MEM + 5% Fetal Bovine Serum, supplemented with 2 mM Gln, ascorbic acid and dexamethasone), GS was suppressed. Conversely, GLS (both KGA and GAC isoforms) and SLC38A2, the gene for the concentrative Gln transporter SNAT2, were induced. These data suggest that hMSCs differentiation in OBs is associated with an increased dependence upon extracellular Gln. Consistent with this conclusion, the activity of SNAT2 was absent in undifferentiated hMSCs but well detectable after 14 days of OB differentiation, when total Gln uptake was also increased. Under the same conditions, OB differentiation markers (RUNX2, COL1A1, ALPL expression and ALPL activity or staining) were significantly induced but their expression was blunted by incubation in low-Gln (0.4 mM) medium or in the presence of the SNAT2 inhibitor MeAIB. The incubation in Gln-free D-MEM suppressed the induction of GLS and SLC38A2 along with OB differentiation, which was restored by the supplementation of Non-Essential Amino Acids (NEAA). Among NEAA, only asparagine (Asn) was able to rescue OB differentiation in the absence of Gln. The determination of intracellular amino acids with MS indicated that OB differentiation was associated with the increase of cell Asn, without significant changes of Gln, glutamate (Glu) or aspartate (Asp). Asparagine Synthetase (ASNS), the Gln-dependent enzyme that accounts for Asn synthesis, was also found induced during OB differentiation of hMSCs. Gene Expression Profiles of primary BM hMSCs and OBs from bone biopsies of both healthy donors (n=7) and MM patients (n=16) indicated that GLS, ASNS, and SLC38A2 are more expressed in OBs, while the expression of GLUL, the gene for GS, is higher in undifferentiated hMSCs from healthy donors. Overall, these results indicate that (1) OB differentiation of hMSCs is Gln-dependent; (2) the partial Gln depletion, imposed by Gln-addicted MM cells in the BM microenvironment, contributes to the impairment of osteoblastic differentiation of hMSCs; (3) hindrance of differentiation may depend on the limited availability of intracellular Asn derived from Gln-dependent ASNS. These results support the evidence that Gln addiction of MM cells affects bone microenvironment leading to the inhibition of OB differentiation and, consequently, to the development of MM bone disease. Disclosures Giuliani: Janssen: Research Funding.

更新日期：2019-11-13

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