氯喹处理诱导自噬相关蛋白的分泌和 Atg8 家族蛋白在不同细胞外囊泡群中的包含,Autophagy

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氯喹处理诱导自噬相关蛋白的分泌和 Atg8 家族蛋白在不同细胞外囊泡群中的包含
Autophagy ( IF 14.6 ) Pub Date : 2022-02-28 , DOI: 10.1080/15548627.2022.2039535
Jing Xu _{1,

2} , Kevin C Yang _{1,

2} , Nancy Erro Go _{1,

2} , Shane Colborne ₁ , Cally J Ho _{1,

2} , Elham Hosseini-Beheshti ₃ , Alf H Lystad _{4,

5} , Anne Simonsen _{4,

5,

6} , Emma Tomlinson Guns _{7,

8} , Gregg B Morin _{1,

8} , Sharon M Gorski _{1,

2,

8,

9}

Affiliation

摘要

氯喹 (CQ) 是一种溶酶体促性剂，通常用于抑制溶酶体降解和巨自噬/自噬。在这里，我们研究了 CQ 对分泌的细胞外在影响。我们发现 CQ 对溶酶体和自噬的抑制改变了分泌蛋白组，并诱导了 Atg8 同源物和自噬受体的释放。特别是 Atg8 家族蛋白以脂化依赖性方式分泌到小细胞外囊泡 (sEV) 中。CQ 处理增强了 sEV 内部 Atg8 家族蛋白的释放。使用全长 ATG16L1 和一个 ATG16L1 突变体，使 Atg8 家族蛋白在双膜而非单膜上脂化，我们证明了 LC3B 在两个不同的 sEV 群体中释放：一个富含 SDCBP/Syntenin-1、CD63 和内体脂化LC3B, 另一个包含 LC3B 但未富含 SDCBP/Syntenin-1 或 CD63，我们的数据支持其源自双膜来源。我们的研究结果强调了 sEV 异质性和组成的背景依赖性，并说明了自噬和 sEV 组成的整合以响应溶酶体抑制。

缩写：ACTB：肌动蛋白β；ANOVA：方差分析；ATG4B：自噬相关的 4B 半胱氨酸肽酶；Atg8：自噬相关8；ATG16L1：自噬相关16 like 1；ATP5F1A/ATP5a：ATP 合酶 F1 亚基 alpha；CALCOCO2：钙结合和卷曲螺旋结构域 2；CASP3：半胱天冬酶 3；CASP7：半胱天冬酶 7；CQ：氯喹；CD9：CD9分子；CD63：CD63分子；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚；DQ-BSA：染料淬灭-牛血清白蛋白；ER：内质网；ERN1/IRE1a：内质网到细胞核的信号转导 1；EV：细胞外囊泡；FBS：胎牛血清；FDR：错误发现率；GABARAP：GABA A 型受体相关蛋白；GABARAPL2：GABA A 型受体相关蛋白 2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GFP：绿色荧光蛋白；GO：基因本体；HCQ：羟氯喹；HSP90AA1：热休克蛋白90α家族A类成员1；IP：免疫沉淀；KO：击倒；LAMP2：溶酶体相关膜蛋白 2；LIR：LC3相互作用区；LMNA：核纤层蛋白 A/C；MAP1LC3B/LC3B：微管相关蛋白 1 轻链 3 β；MS：质谱法；NBR1：NBR1 自噬货物受体；NCOA4：核受体共激活因子 4；NTA：纳米粒子跟踪分析；PE：磷脂酰乙醇胺；PECA：探针级表达变化平均；SDCBP/syntenin-1：多聚糖结合蛋白；SD：标准差；SE：分泌的；sEV：小细胞外囊泡；SQSTM1/p62：螯合体 1；TAX1BP1：Tax1 结合蛋白 1；TEM：透射电子显微镜；TMT：串联质量标签；TSG101：肿瘤易感性101；ULK1：unc-51 样自噬激活激酶 1；WC：全细胞免疫沉淀；KO：击倒；LAMP2：溶酶体相关膜蛋白 2；LIR：LC3相互作用区；LMNA：核纤层蛋白 A/C；MAP1LC3B/LC3B：微管相关蛋白 1 轻链 3 β；MS：质谱法；NBR1：NBR1 自噬货物受体；NCOA4：核受体共激活因子 4；NTA：纳米粒子跟踪分析；PE：磷脂酰乙醇胺；PECA：探针级表达变化平均；SDCBP/syntenin-1：多聚糖结合蛋白；SD：标准偏差；SE：分泌的；sEV：小细胞外囊泡；SQSTM1/p62：螯合体 1；TAX1BP1：Tax1 结合蛋白 1；TEM：透射电子显微镜；TMT：串联质量标签；TSG101：肿瘤易感性101；ULK1：unc-51 样自噬激活激酶 1；WC：全细胞免疫沉淀；KO：击倒；LAMP2：溶酶体相关膜蛋白 2；LIR：LC3相互作用区；LMNA：核纤层蛋白 A/C；MAP1LC3B/LC3B：微管相关蛋白 1 轻链 3 β；MS：质谱法；NBR1：NBR1 自噬货物受体；NCOA4：核受体共激活因子 4；NTA：纳米粒子跟踪分析；PE：磷脂酰乙醇胺；PECA：探针级表达变化平均；SDCBP/syntenin-1：多聚糖结合蛋白；SD：标准偏差；SE：分泌的；sEV：小细胞外囊泡；SQSTM1/p62：螯合体 1；TAX1BP1：Tax1 结合蛋白 1；TEM：透射电子显微镜；TMT：串联质量标签；TSG101：肿瘤易感性101；ULK1：unc-51 样自噬激活激酶 1；WC：全细胞 MAP1LC3B/LC3B：微管相关蛋白 1 轻链 3 β；MS：质谱法；NBR1：NBR1 自噬货物受体；NCOA4：核受体共激活因子 4；NTA：纳米粒子跟踪分析；PE：磷脂酰乙醇胺；PECA：探针级表达变化平均；SDCBP/syntenin-1：多聚糖结合蛋白；SD：标准偏差；SE：分泌的；sEV：小细胞外囊泡；SQSTM1/p62：螯合体 1；TAX1BP1：Tax1 结合蛋白 1；TEM：透射电子显微镜；TMT：串联质量标签；TSG101：肿瘤易感性101；ULK1：unc-51 样自噬激活激酶 1；WC：全细胞 MAP1LC3B/LC3B：微管相关蛋白 1 轻链 3 β；MS：质谱法；NBR1：NBR1 自噬货物受体；NCOA4：核受体共激活因子 4；NTA：纳米粒子跟踪分析；PE：磷脂酰乙醇胺；PECA：探针级表达变化平均；SDCBP/syntenin-1：多聚糖结合蛋白；SD：标准偏差；SE：分泌的；sEV：小细胞外囊泡；SQSTM1/p62：螯合体 1；TAX1BP1：Tax1 结合蛋白 1；TEM：透射电子显微镜；TMT：串联质量标签；TSG101：肿瘤易感性101；ULK1：unc-51 样自噬激活激酶 1；WC：全细胞探针级表达变化平均；SDCBP/syntenin-1：多聚糖结合蛋白；SD：标准偏差；SE：分泌的；sEV：小细胞外囊泡；SQSTM1/p62：螯合体 1；TAX1BP1：Tax1 结合蛋白 1；TEM：透射电子显微镜；TMT：串联质量标签；TSG101：肿瘤易感性101；ULK1：unc-51 样自噬激活激酶 1；WC：全细胞探针级表达变化平均；SDCBP/syntenin-1：多聚糖结合蛋白；SD：标准偏差；SE：分泌的；sEV：小细胞外囊泡；SQSTM1/p62：螯合体 1；TAX1BP1：Tax1 结合蛋白 1；TEM：透射电子显微镜；TMT：串联质量标签；TSG101：肿瘤易感性101；ULK1：unc-51 样自噬激活激酶 1；WC：全细胞

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Chloroquine treatment induces secretion of autophagy-related proteins and inclusion of Atg8-family proteins in distinct extracellular vesicle populations

ABSTRACT

Chloroquine (CQ), a lysosomotropic agent, is commonly used to inhibit lysosomal degradation and macroautophagy/autophagy. Here we investigated the cell-extrinsic effects of CQ on secretion. We showed that lysosomal and autophagy inhibition by CQ altered the secretome, and induced the release of Atg8 orthologs and autophagy receptors. Atg8-family proteins, in particular, were secreted inside small extracellular vesicles (sEVs) in a lipidation-dependent manner. CQ treatment enhanced the release of Atg8-family proteins inside sEVs. Using full-length ATG16L1 and an ATG16L1 mutant that enables Atg8-family protein lipidation on double but not on single membranes, we demonstrated that LC3B is released in two distinct sEV populations: one enriched with SDCBP/Syntenin-1, CD63, and endosomal lipidated LC3B, and another that contains LC3B but is not enriched with SDCBP/Syntenin-1 or CD63, and which our data supports as originating from a double-membrane source. Our findings underscore the context-dependency of sEV heterogeneity and composition, and illustrate the integration of autophagy and sEV composition in response to lysosomal inhibition.

Abbreviations: ACTB: actin beta; ANOVA: analysis of variance; ATG4B: autophagy related 4B cysteine peptidase; Atg8: autophagy related 8; ATG16L1: autophagy related 16 like 1; ATP5F1A/ATP5a: ATP synthase F1 subunit alpha; CALCOCO2: calcium binding and coiled-coil domain 2; CASP3: caspase 3; CASP7: caspase 7; CQ: chloroquine; CD9: CD9 molecule; CD63: CD63 molecule; DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindole; DQ-BSA: dye quenched-bovine serum albumin; ER: endoplasmic reticulum; ERN1/IRE1a: endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1; EV: extracellular vesicles; FBS: fetal bovine serum; FDR: false discovery rate; GABARAP: GABA type A receptor-associated protein; GABARAPL2: GABA type A receptor associated protein like 2; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GFP: green fluorescent protein; GO: gene ontology; HCQ: hydroxychloroquine; HSP90AA1: heat shock protein 90 alpha family class A member 1; IP: immunoprecipitation; KO: knockout; LAMP2: lysosomal associated membrane protein 2; LIR: LC3-interacting region; LMNA: lamin A/C; MAP1LC3B/LC3B: microtubule associated protein 1 light chain 3 beta; MS: mass spectrometry; NBR1: NBR1 autophagy cargo receptor; NCOA4: nuclear receptor coactivator 4; NTA: nanoparticle tracking analysis; PE: phosphatidylethanolamine; PECA: probe-level expression change averaging; SDCBP/syntenin-1: syndecan binding protein; SD: standard deviation; SE: secreted; sEV: small extracellular vesicles; SQSTM1/p62: sequestosome 1; TAX1BP1: Tax1 binding protein 1; TEM: transmission electron microscopy; TMT: tandem-mass tag; TSG101: tumor susceptibility 101; ULK1: unc-51 like autophagy activating kinase 1; WC: whole cell

更新日期：2022-02-28

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