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Improved Identification of Proteoforms in Top-Down Proteomics Using FAIMS with Internal CV Stepping
Analytical Chemistry ( IF 6.7 ) Pub Date : 2022-02-16 , DOI: 10.1021/acs.analchem.1c05123
Philipp T Kaulich 1 , Liam Cassidy 1 , Konrad Winkels 1 , Andreas Tholey 1
Analytical Chemistry ( IF 6.7 ) Pub Date : 2022-02-16 , DOI: 10.1021/acs.analchem.1c05123
Philipp T Kaulich 1 , Liam Cassidy 1 , Konrad Winkels 1 , Andreas Tholey 1
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In top-down (TD) proteomics, prefractionation prior to mass spectrometric (MS) analysis is a crucial step for both the high confidence identification of proteoforms and increased proteome coverage. In addition to liquid-phase separations, gas-phase fractionation strategies such as field asymmetric ion mobility spectrometry (FAIMS) have been shown to be highly beneficial in TD proteomics. However, so far, only external compensation voltage (CV) stepping has been demonstrated for TD proteomics, i.e., single CVs were applied for each run. Here, we investigated the use of internal CV stepping (multiple CVs per acquisition) for single-shot TD analysis, which has huge advantages in terms of measurement time and the amount of sample required. In addition, MS parameters were optimized for the individual CVs since different CVs target certain mass ranges. For example, small proteoforms identified mainly with more negative CVs can be identified with lower resolution and number of microscans than larger proteins identified primarily via less negative CVs. We investigated the optimal combination and number of CVs for different gradient lengths and validated the optimized settings with the low-molecular-weight proteome of CaCo-2 cells obtained using a range of different sample preparation techniques. Compared to measurements without FAIMS, both the number of identified protein groups (+60–94%) and proteoforms (+46–127%) and their confidence were significantly increased, while the measurement time remained identical. In total, we identified 684 protein groups and 2675 proteoforms from CaCo-2 cells in less than 24 h using the optimized multi-CV method.
中文翻译：
使用具有内部 CV 步进的 FAIMS 改进自上而下蛋白质组学中蛋白质型的识别
在自上而下 (TD) 蛋白质组学中，质谱 (MS) 分析之前的预分馏对于蛋白质型的高置信度鉴定和增加蛋白质组覆盖率都是至关重要的一步。除了液相分离，气相分馏策略如场不对称离子迁移谱 (FAIMS) 已被证明在 TD 蛋白质组学中非常有益。然而，到目前为止，仅针对 TD 蛋白质组学证明了外部补偿电压 (CV) 步进，即每次运行都应用单个 CV。在这里，我们研究了使用内部 CV 步进（每次采集多个 CV）进行单次 TD 分析，这在测量时间和所需样本量方面具有巨大优势。此外，由于不同的 CV 针对特定的质量范围，因此针对各个 CV 优化了 MS 参数。例如，与主要通过较少负 CV 识别的较大蛋白质相比，主要具有更多负 CV 的小蛋白质可以以较低的分辨率和显微扫描数进行识别。我们研究了不同梯度长度的 CV 的最佳组合和数量，并使用一系列不同的样品制备技术获得的 CaCo-2 细胞的低分子量蛋白质组验证了优化设置。与没有 FAIMS 的测量相比，已识别的蛋白质组 (+60–94%) 和蛋白质组 (+46–127%) 的数量及其置信度均显着增加，而测量时间保持不变。总的来说，我们使用优化的多 CV 方法在不到 24 小时内从 CaCo-2 细胞中鉴定了 684 个蛋白质组和 2675 个蛋白质型。与主要通过较少负 CV 鉴定的较大蛋白质相比，主要具有更多负 CV 鉴定的小蛋白质型可以以较低的分辨率和显微扫描数量鉴定。我们研究了不同梯度长度的 CV 的最佳组合和数量，并使用一系列不同的样品制备技术获得的 CaCo-2 细胞的低分子量蛋白质组验证了优化设置。与没有 FAIMS 的测量相比，已识别的蛋白质组 (+60–94%) 和蛋白质组 (+46–127%) 的数量及其置信度均显着增加，而测量时间保持不变。总的来说，我们使用优化的多 CV 方法在不到 24 小时内从 CaCo-2 细胞中鉴定了 684 个蛋白质组和 2675 个蛋白质型。与主要通过较少负 CV 鉴定的较大蛋白质相比，主要具有更多负 CV 鉴定的小蛋白质型可以以较低的分辨率和显微扫描数量鉴定。我们研究了不同梯度长度的 CV 的最佳组合和数量，并使用一系列不同的样品制备技术获得的 CaCo-2 细胞的低分子量蛋白质组验证了优化设置。与没有 FAIMS 的测量相比，已识别的蛋白质组 (+60–94%) 和蛋白质组 (+46–127%) 的数量及其置信度均显着增加，而测量时间保持不变。总的来说，我们使用优化的多 CV 方法在不到 24 小时内从 CaCo-2 细胞中鉴定了 684 个蛋白质组和 2675 个蛋白质型。
更新日期：2022-02-16
中文翻译：
使用具有内部 CV 步进的 FAIMS 改进自上而下蛋白质组学中蛋白质型的识别
在自上而下 (TD) 蛋白质组学中，质谱 (MS) 分析之前的预分馏对于蛋白质型的高置信度鉴定和增加蛋白质组覆盖率都是至关重要的一步。除了液相分离，气相分馏策略如场不对称离子迁移谱 (FAIMS) 已被证明在 TD 蛋白质组学中非常有益。然而，到目前为止，仅针对 TD 蛋白质组学证明了外部补偿电压 (CV) 步进，即每次运行都应用单个 CV。在这里，我们研究了使用内部 CV 步进（每次采集多个 CV）进行单次 TD 分析，这在测量时间和所需样本量方面具有巨大优势。此外，由于不同的 CV 针对特定的质量范围，因此针对各个 CV 优化了 MS 参数。例如，与主要通过较少负 CV 识别的较大蛋白质相比，主要具有更多负 CV 的小蛋白质可以以较低的分辨率和显微扫描数进行识别。我们研究了不同梯度长度的 CV 的最佳组合和数量，并使用一系列不同的样品制备技术获得的 CaCo-2 细胞的低分子量蛋白质组验证了优化设置。与没有 FAIMS 的测量相比，已识别的蛋白质组 (+60–94%) 和蛋白质组 (+46–127%) 的数量及其置信度均显着增加，而测量时间保持不变。总的来说，我们使用优化的多 CV 方法在不到 24 小时内从 CaCo-2 细胞中鉴定了 684 个蛋白质组和 2675 个蛋白质型。与主要通过较少负 CV 鉴定的较大蛋白质相比，主要具有更多负 CV 鉴定的小蛋白质型可以以较低的分辨率和显微扫描数量鉴定。我们研究了不同梯度长度的 CV 的最佳组合和数量，并使用一系列不同的样品制备技术获得的 CaCo-2 细胞的低分子量蛋白质组验证了优化设置。与没有 FAIMS 的测量相比，已识别的蛋白质组 (+60–94%) 和蛋白质组 (+46–127%) 的数量及其置信度均显着增加，而测量时间保持不变。总的来说，我们使用优化的多 CV 方法在不到 24 小时内从 CaCo-2 细胞中鉴定了 684 个蛋白质组和 2675 个蛋白质型。与主要通过较少负 CV 鉴定的较大蛋白质相比，主要具有更多负 CV 鉴定的小蛋白质型可以以较低的分辨率和显微扫描数量鉴定。我们研究了不同梯度长度的 CV 的最佳组合和数量，并使用一系列不同的样品制备技术获得的 CaCo-2 细胞的低分子量蛋白质组验证了优化设置。与没有 FAIMS 的测量相比，已识别的蛋白质组 (+60–94%) 和蛋白质组 (+46–127%) 的数量及其置信度均显着增加，而测量时间保持不变。总的来说，我们使用优化的多 CV 方法在不到 24 小时内从 CaCo-2 细胞中鉴定了 684 个蛋白质组和 2675 个蛋白质型。
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