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Molecular Basis for a Toluene Monooxygenase to Govern Substrate Selectivity
ACS Catalysis ( IF 11.3 ) Pub Date : 2022-02-13 , DOI: 10.1021/acscatal.1c05845 Chun-Chi Chen 1 , Meng Dai 1 , Lilan Zhang 1 , Jing Zhao 1 , Wei Zeng 1 , Min Shi 1 , Jian-Wen Huang 1 , Weidong Liu 2 , Rey-Ting Guo 1 , Aitao Li 1
ACS Catalysis ( IF 11.3 ) Pub Date : 2022-02-13 , DOI: 10.1021/acscatal.1c05845 Chun-Chi Chen 1 , Meng Dai 1 , Lilan Zhang 1 , Jing Zhao 1 , Wei Zeng 1 , Min Shi 1 , Jian-Wen Huang 1 , Weidong Liu 2 , Rey-Ting Guo 1 , Aitao Li 1
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Class I P450 monooxygenase from Rhodococcus coprophilus TC-2, termed P450tol, is the only naturally evolved toluene hydroxylating enzyme known to hydroxylate toluene to produce benzyl alcohol. To investigate its mechanism of action, we solved the unique crystal structures of P450tol and its complex with the substrate. The complex structure indicates that P450tol restricts the toluene binding position with several hydrophobic residues, such that the hydroxylation could take place precisely on the benzylic site. Notably, we found additional space in the toluene-binding pocket and thus examined P450tol activity toward larger substrates. As a result, several halogenated toluenes can also be hydroxylated by P450tol on the benzylic site. We also conducted site saturation mutagenesis (SSM) to enable subterminal or benzylic hydroxylation of propylbenzene. The resulting enantiopure alcohols are essential intermediates for the synthesis of important pharmaceuticals. To facilitate further applications, we fused P450tol and reductase domain derived from self-sufficient P450s. The chimeric enzymes containing the CYP116B46 reductase domain from thermophilic Tepidiphilus thermophiles (P450tol-CYP116B46) exhibit higher thermostability and catalytic activity than the one containing RhFRED reductase domain from mesophilic Rhodococcus sp. strain NCIMB 9784. In conclusion, we manifested the origin of regioselectivity of P450tol-catalyzed benzylic hydroxylation and explored the versatility in substrate utilization of P450tol. Furthermore, the self-sufficient chimeric enzyme with high catalytic activity and stability was generated. We are convinced that these results highlight the great potentials of P450tol in biotechnological and pharmaceutical applications.
中文翻译：
甲苯单加氧酶控制底物选择性的分子基础
来自粪红球菌的I 类 P450 单加氧酶TC-2，称为 P450tol，是唯一一种天然进化的甲苯羟基化酶，已知可将甲苯羟基化以产生苯甲醇。为了研究其作用机制，我们解决了 P450tol 的独特晶体结构及其与底物的复合物。复杂的结构表明 P450tol 用几个疏水残基限制了甲苯的结合位置，因此羟基化可以精确地发生在苄基位点上。值得注意的是，我们在甲苯结合口袋中发现了额外的空间，因此检查了 P450tol 对更大底物的活性。因此，一些卤代甲苯也可以被 P450tol 在苄基位点上羟基化。我们还进行了位点饱和诱变 (SSM)，以实现丙苯的亚末端或苄基羟基化。所得对映纯醇是合成重要药物的必要中间体。为了促进进一步的应用，我们融合了 P450tol 和源自自给自足 P450 的还原酶结构域。含有来自嗜热细胞的 CYP116B46 还原酶结构域的嵌合酶嗜热嗜热菌(P450tol-CYP116B46) 表现出比含有来自嗜温红球菌属的 RhFRED 还原酶结构域的更高的热稳定性和催化活性。菌株 NCIMB 9784。 总之，我们证明了 P450tol 催化的苄基羟基化的区域选择性的起源，并探索了 P450tol 底物利用的多功能性。此外，还产生了具有高催化活性和稳定性的自给自足嵌合酶。我们相信，这些结果突出了 P450tol 在生物技术和制药应用中的巨大潜力。
更新日期：2022-02-13
中文翻译：
甲苯单加氧酶控制底物选择性的分子基础
来自粪红球菌的I 类 P450 单加氧酶TC-2，称为 P450tol，是唯一一种天然进化的甲苯羟基化酶，已知可将甲苯羟基化以产生苯甲醇。为了研究其作用机制，我们解决了 P450tol 的独特晶体结构及其与底物的复合物。复杂的结构表明 P450tol 用几个疏水残基限制了甲苯的结合位置，因此羟基化可以精确地发生在苄基位点上。值得注意的是，我们在甲苯结合口袋中发现了额外的空间，因此检查了 P450tol 对更大底物的活性。因此，一些卤代甲苯也可以被 P450tol 在苄基位点上羟基化。我们还进行了位点饱和诱变 (SSM)，以实现丙苯的亚末端或苄基羟基化。所得对映纯醇是合成重要药物的必要中间体。为了促进进一步的应用，我们融合了 P450tol 和源自自给自足 P450 的还原酶结构域。含有来自嗜热细胞的 CYP116B46 还原酶结构域的嵌合酶嗜热嗜热菌(P450tol-CYP116B46) 表现出比含有来自嗜温红球菌属的 RhFRED 还原酶结构域的更高的热稳定性和催化活性。菌株 NCIMB 9784。 总之，我们证明了 P450tol 催化的苄基羟基化的区域选择性的起源，并探索了 P450tol 底物利用的多功能性。此外，还产生了具有高催化活性和稳定性的自给自足嵌合酶。我们相信，这些结果突出了 P450tol 在生物技术和制药应用中的巨大潜力。
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