Analytical and Bioanalytical Chemistry ( IF 3.8 ) Pub Date : 2021-11-02 , DOI: 10.1007/s00216-021-03731-8 Daniel H Ramirez 1, 2 , Bo Yang 1 , Alexandria K D'Souza 1 , Dacheng Shen 1 , Christina M Woo 1
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O-GlcNAc transferase (OGT) is an essential enzyme that installs O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) to thousands of protein substrates. OGT and its isoforms select from these substrates through the tetratricopeptide repeat (TPR) domain, yet the impact of truncations to the TPR domain on substrate and glycosite selection is unresolved. Here, we report the effects of iterative truncations to the TPR domain of OGT on substrate and glycosite selection with the model protein GFP-JunB and the surrounding O-GlcNAc proteome in U2OS cells. Iterative truncation of the TPR domain of OGT maintains glycosyltransferase activity but alters subcellular localization of OGT in cells. The glycoproteome and glycosites modified by four OGT TPR isoforms were examined on the whole proteome and a single target protein, GFP-JunB. We found the greatest changes in O-GlcNAc on proteins associated with mRNA splicing processes and that the first four TPRs of the canonical nucleocytoplasmic OGT had the broadest substrate scope. Subsequent glycosite analysis revealed that alteration to the last four TPRs corresponded to the greatest shift in the resulting O-GlcNAc consensus sequence. This dataset provides a foundation to analyze how perturbations to the TPR domain and expression of OGT isoforms affect the glycosylation of substrates, which will be critical for future efforts in protein engineering of OGT, the biology of OGT isoforms, and diseases associated with the TPR domain of OGT.
Graphical abstract
中文翻译：
OGT 的 TPR 结构域的截断改变了底物和糖苷的选择
O-GlcNAc 转移酶 (OGT) 是一种必需的酶，可将 O-连接的 N-乙酰氨基葡萄糖 (O-GlcNAc) 安装到数千种蛋白质底物上。OGT 及其亚型通过四肽重复 (TPR) 结构域从这些底物中进行选择，但 TPR 结构域截短对底物和糖基选择的影响尚未解决。在这里，我们使用模型蛋白 GFP-JunB 和 U2OS 细胞中周围的 O-GlcNAc 蛋白质组报告了 OGT 的 TPR 域的迭代截断对底物和糖基选择的影响。OGT 的 TPR 结构域的迭代截断保持了糖基转移酶活性，但改变了 OGT 在细胞中的亚细胞定位。在整个蛋白质组和单个靶蛋白 GFP-JunB 上检查了由四种 OGT TPR 亚型修饰的糖蛋白组和糖位点。我们发现 O-GlcNAc 对与 mRNA 剪接过程相关的蛋白质的最大变化，并且典型核质 OGT 的前四个 TPR 具有最广泛的底物范围。随后的糖苷分析显示，对最后四个 TPR 的改变对应于所得 O-GlcNAc 共有序列的最大变化。该数据集为分析 TPR 结构域的扰动和 OGT 亚型的表达如何影响底物的糖基化提供了基础，这对于未来在 OGT 蛋白质工程、OGT 亚型生物学以及与 TPR 结构域相关的疾病方面的努力至关重要OGT。随后的糖苷分析显示，对最后四个 TPR 的改变对应于所得 O-GlcNAc 共有序列的最大变化。该数据集为分析 TPR 结构域的扰动和 OGT 亚型的表达如何影响底物的糖基化提供了基础，这对于未来在 OGT 蛋白质工程、OGT 亚型生物学以及与 TPR 结构域相关的疾病方面的努力至关重要OGT。随后的糖苷分析显示，对最后四个 TPR 的改变对应于所得 O-GlcNAc 共有序列的最大变化。该数据集为分析 TPR 结构域的扰动和 OGT 亚型的表达如何影响底物的糖基化提供了基础，这对于未来在 OGT 蛋白质工程、OGT 亚型生物学以及与 TPR 结构域相关的疾病方面的努力至关重要OGT。
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