摘要使用条件降解决定子进行靶向蛋白质消耗是探测蛋白质在活细胞中的作用的有效方法，因为诱导消耗的速度及其可逆性。生长素诱导降解决定子 (AID) 是细胞生物学中最常见的基于降解决定子的技术之一。我们最近建立了一个改进的系统，称为 AID2，它涉及表达突变的 E3 连接酶亚基 OsTIR1(F74G)，并将感兴趣的蛋白质融合到 mini-AID (mAID) 标签上，并采用新的更有效的配体， 5-苯基-吲哚-3-乙酸（5-Ph-IAA）。AID2系统克服了与原始AID系统相关的一些缺点，即没有生长素的泄漏降解以及需要高生长素剂量。因此，使用 AID2，现在可以更精确地控制降解决定子融合蛋白，通过添加低剂量的 5-Ph-IAA，使靶蛋白以 10 至 45 分钟的半衰期降解。重要的是，在 AID2 中，无需控制 OsTIR1(F74G) 的表达来抑制渗漏降解，并且组成型表达 OsTIR1(F74G) 的亲本细胞系可用于生成多个 mAID 标记蛋白。在这里，我们描述了在二倍体 HCT116 细胞中用 mAID 标记内源蛋白的方案。我们的方案可应用于其他哺乳动物细胞系，并将增强 AID2 在研究活细胞中蛋白质功能方面的效用。© 2021 Wiley 期刊有限责任公司。基本协议1: 表达 OsTIR1(F74G) 的亲代 HCT116 细胞系的产生基本协议2: 用于标记内源基因的 CRISPR 和供体质粒的构建基本协议3: 表达与 mAID 融合的目的蛋白的细胞系的生成



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