摘要 1055 背景：Cereblon (CRBN) 是 E3 泛素连接酶复合物的一个组成部分，包括 CUL4A、DDB1 和 ROC-1，被发现是沙利度胺 (Thalomid®)、来那度胺 (Revlimid®) 和泊马度胺。CC-220 是一种新型免疫调节化合物，其效力增强，目前正在开发用于治疗免疫疾病。分析了 CC-220 对 CRBN 结合、泛素化和细胞增殖的影响。方法：在竞争性测定中使用沙利度胺类似物缀合的珠子进行与 CRBN 的结合研究。来自人类 U266 多发性骨髓瘤 (MM) 细胞的内源性 CRBN 通过将细胞提取物与不同浓度的 CC-220 或泊马度胺作为阳性对照一起孵育来测量。将与沙利度胺酸类似物偶联的亲和珠与 U266 提取物一起孵育，并在对珠进行充分洗涤后，洗脱结合的蛋白质。通过定量 CRBN 免疫印迹测定确定 CRBN 与沙利度胺偶联的亲和珠的结合。在 HEK293T 细胞中测量 CRBN 泛素化，这些细胞用氨基末端 His-生物素标记的 CRBN 构建体转染，然后与化合物预孵育 1 小时，然后用 MG132 蛋白酶体抑制剂处理（以阻止泛素化蛋白质的降解）。裂解细胞并处理以通过 SDS-PAGE 和使用抗泛素抗体的免疫印迹分析测量 CRBN 泛素化。在来那度胺敏感性和难治性多发性骨髓瘤细胞中进行细胞增殖研究。来那度胺耐药或敏感的 H929 MM 细胞系用 CC-220 处理 5 天，然后通过 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）染色评估细胞增殖和活力。使用固定化抗 CD3 抗体在细胞培养物中刺激 2 天，在纯化的原代人 T 细胞中测量 T 细胞共刺激，并通过 ELISA 测量细胞因子分泌。通过在 B 细胞分化因子重组人 IL-2 (20 U/mL)、IL-10 (50 ng/mL) 存在下培养，测量正常供体外周血单核细胞的免疫球蛋白 M 和 G（IgG 和 IgM）产生)、IL-15 (10 ng/mL)、His 标记的 CD40 配体 (50 ng/mL)、多组氨酸小鼠 IgG1 抗体 (5 μg/mL) 和 ODN 2006-人类 TLR9 配体 (10 μg/mL) 4天，然后是 IL-2、IL-10、IL-15 和 IL-6 (50 ng/mL)，再持续 3 天。IgM和IgG通过ELISA测量。结果：在竞争性 CRBN 结合研究中，使用 3 μM 浓度的泊马度胺预培养导致与亲和珠结合的 CRBN 减少约 50%，而浓度为 0.1 μM 的 CC-220 导致类似的 CRBN 结合。转染的 HEK293T 细胞中的 CRBN 泛素化研究产生以下效力：CC-220 IC50 = 0.19 μM；来那度胺 IC50 = 12.9 μM；和泊马度胺 IC50 = 21.6 μM。CC-220 抑制增殖的 IC50 值从亲本 H929 细胞系中的 0.01 μM 和 DMSO 处理的亚克隆中的 0.04 μM 转变为来那度胺抗性亚克隆中的 0.51–1.58 μM。用 CC-220 处理 H929 细胞 24 小时后，细胞周期（S 期）明显减少 50%。在 48 小时，CC-220 降低存活蛋白和成视网膜细胞瘤蛋白 (pRB) 的表达，并增加细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 的表达。CC-220 共刺激 T 细胞产生 IL-2，EC50 约为 0.29 nM，而泊马度胺为 10 nM。CC-220 抑制 IgM 和 IgG 的产生，IC50 分别为 0.35 和 2.1 nM，而泊马度胺的 IC50 为 17 nM 和 63 nM。结论：结果表明，CC-220 与 CRBN 的结合亲和力比泊马度胺高约 30 倍，并在该系统中以比泊马度胺高约 110 倍的效力抑制 CRBN 泛素化。CC-220 在共刺激 T 细胞产生 IL-2 方面比泊马度胺强约 34 倍，在抑制免疫球蛋白生成方面比泊马度胺强 30 至 48 倍。总之，CC-220 是一种新型高亲和力 CRBN 配体，其细胞效力比泊马度胺高 1 或 2 个数量级，目前正在开发用于治疗免疫疾病，包括涉及 B 细胞恶液质的疾病。披露：Schafer：Celgene：就业、股权。Rychak：Celgene：就业、股权。Mendy：Celgene 公司：就业、股权。Parton：Celgene Corp：就业，股权。Capone：Celgene 公司：就业、股权。Lopez-Girona：Celgene 公司：就业、股权。Daniel：Celgene 公司：就业。Chopra：Celgene 公司：就业、股权。包括那些涉及 B 细胞恶液质的疾病。披露：Schafer：Celgene：就业、股权。Rychak：Celgene：就业、股权。Mendy：Celgene 公司：就业、股权。Parton：Celgene Corp：就业，股权。Capone：Celgene 公司：就业、股权。Lopez-Girona：Celgene 公司：就业、股权。Daniel：Celgene 公司：就业。Chopra：Celgene 公司：就业、股权。包括那些涉及 B 细胞恶液质的疾病。披露：Schafer：Celgene：就业、股权。Rychak：Celgene：就业、股权。Mendy：Celgene 公司：就业、股权。Parton：Celgene Corp：就业，股权。Capone：Celgene 公司：就业、股权。Lopez-Girona：Celgene 公司：就业、股权。Daniel：Celgene 公司：就业。Chopra：Celgene 公司：就业、股权。



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