Toll样受体4（TLR4）是感知细菌脂多糖（LPS）的关键受体，并且是Toll样受体家族中研究最多的成员（Kawai和Akira，2007; Kayagaki等人，2013; Klein等人。 ，2015年）。细胞表面TLR4的表达取决于受体从高尔基体转运到细胞膜与细胞表面受体向内体区室内化之间的平衡（Saltoh，2009）。在骨髓源性巨噬细胞（BMDM）中，我们观察到LPS诱导的BMDM表面EGFR磷酸化，并被PD168393或TAPI-1预处理抑制（图S1）。接下来，我们测量了LPS处理后细胞表面TLR4表达的动态变化。LPS处理后第6、12和24小时，BMDM表面的TLR4表达分别增加了约2倍，约6倍和约9倍。与对照相比。但是，EGFR抑制剂PD168393在所有时间点均抑制LPS介导的TLR4细胞表面表达的增加（图1A和1B）。在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中也证实了这些改变（图S2）。然后，在LPS之前30分钟向C57BL / 6小鼠腹膜内（ip）注射或不注射EGFR抑制剂埃洛替尼（100 mg / kg BW，管饲）的LPS（10 mg / kg）。LPS处理后24小时，收集腹膜巨噬细胞。LPS诱导巨噬细胞表面TLR4表达增加5倍，厄洛替尼预处理可响应LPS抑制TLR4细胞表面表达（图1C和1D）。然后，用LPS处理EGFR小鼠的BMDM细胞24小时，与WT BMDM细胞相比，LPS处理无法诱导EGFR BMDM中TLR4的细胞表面表达增加（图1E和1F）。体内显示了相似的发现（图1G和1H），与WT小鼠相反，在LPS攻击后24小时，EGFR小鼠腹膜巨噬细胞上TLR4表面的表达没有增加。这些发现表明，EGFR磷酸化对于巨噬细胞中LPS诱导的TLR4细胞表面表达的上调是必不可少的。EGFR磷酸化抑制剂PD168393有效抑制LPS诱导的TLR4磷酸化（图1I）。此外，在EGFR BMDM中LPS诱导的TLR4磷酸化显着降低（图1J）。我们将TLR4 674和688 Tyr的磷酸化位点突变为Ala，然后用MD2，CD14，EGFR和TLR4或TLR4突变体。LPS处理不能导致TLR4突变组的EGFR磷酸化（图1K和1L）。我们还测量了TLR4磷酸化对TLR4细胞膜表达的影响。LPS处理后24小时，与表达WT-TLR4的细胞相比，在表达TLR4的细胞中LPS诱导的TLR4的细胞表面表达明显降低（图1M和1N）。LPS处理后30分钟，LPS还诱导BMDM中TLR4和EGFR的共定位，这被EGFR磷酸化抑制剂PD168393抑制（图1O）。此外，响应LPS，TLR4和EGFR之间的这种共定位也取决于TLR4的磷酸化（图S3）。但是，在对照，LPS或LPS加PD168393预处理中，EGFR不能与TLR4共同免疫沉淀（图1P）。我们进一步发现，LPS在6、12和24小时显着增加EGFR，但不显着增加TLR4，mRNA和总蛋白表达，而PD168393预处理可抑制此现象（图S4A–D）。TLR4受体的大部分存储在亚细胞区室中，例如高尔基体和内体（Husebye等，2006）。由于EGFR抑制剂响应LPS降低了细胞表面但未降低总TLR4表达，因此我们假设EGFR磷酸化有助于TLR4从高尔基体转运到细胞表面。高尔基体标记GM130用于可视化BMDM中高尔基体与TLR4之间的空间关系。如图1Q所示，LPS处理降低了GM130和TLR4的共定位，PD168393预处理部分恢复了高尔基体和TLR4之间的共定位。同时，LPS失去了减少EGFR BMDM中GM130和TLR4之间共定位的能力（图1R）。这些数据表明，LPS处理后TLR4从高尔基体转运到细胞表面，这受EGFR磷酸化的调节。Rab5a是EGFR的重要下游信号分子，在肌动蛋白重塑，TLR4MyD88相互作用和受体内化中起关键作用（Chen等，



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