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The bridge helix of Cas12a imparts selectivity in cis‐DNA cleavage and regulates trans‐DNA cleavage
FEBS Letters ( IF 3.0 ) Pub Date : 2021-02-01 , DOI: 10.1002/1873-3468.14051 Hari Priya Parameshwaran 1 , Kesavan Babu 1 , Christine Tran 1 , Kevin Guan 1 , Aleique Allen 2 , Venkatesan Kathiresan 2 , Peter Z Qin 2 , Rakhi Rajan 1
FEBS Letters ( IF 3.0 ) Pub Date : 2021-02-01 , DOI: 10.1002/1873-3468.14051 Hari Priya Parameshwaran 1 , Kesavan Babu 1 , Christine Tran 1 , Kevin Guan 1 , Aleique Allen 2 , Venkatesan Kathiresan 2 , Peter Z Qin 2 , Rakhi Rajan 1
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Cas12a is an RNA‐guided DNA endonuclease of the type V‐A CRISPR‐Cas system that has evolved convergently with the type II Cas9 protein. We previously showed that proline substitutions in the bridge helix (BH) impart target DNA cleavage selectivity in Streptococcus pyogenes (Spy) Cas9. Here, we examined a BH variant of Cas12a from Francisella novicida (FnoCas12aKD2P) to test mechanistic conservation. Our results show that for RNA‐guided DNA cleavage (cis‐activity), FnoCas12aKD2P accumulates nicked products while cleaving supercoiled DNA substrates with mismatches, with certain mismatch positions being more detrimental for linearization. FnoCas12aKD2P also possess reduced trans‐single‐stranded DNA cleavage activity. These results implicate the BH in substrate selectivity in both cis‐ and trans‐cleavages and show its conserved role in target discrimination among Cas nucleases.
中文翻译：
Cas12a 的桥螺旋赋予顺式 DNA 切割选择性并调节反式 DNA 切割
Cas12a 是 V-A 型 CRISPR-Cas 系统的 RNA 引导 DNA 核酸内切酶，与 II 型 Cas9 蛋白趋同进化。我们之前表明，桥螺旋 (BH) 中的脯氨酸取代赋予化脓性链球菌(Spy) Cas9 中靶标 DNA 切割的选择性。在这里，我们检查了来自新杀弗朗西斯菌(FnoCas12a KD2P ) 的 Cas12a 的 BH 变体，以测试机制保守性。我们的结果表明，对于 RNA 引导的 DNA 切割（顺式活性），FnoCas12a KD2P会积累带切口的产物，同时切割具有错配的超螺旋 DNA 底物，某些错配位置对线性化更加不利。 FnoCas12a KD2P还具有降低的反式单链 DNA 切割活性。这些结果表明 BH 在顺式和反式切割中的底物选择性中发挥着重要作用，并显示了其在 Cas 核酸酶的靶标识别中的保守作用。
更新日期：2021-04-12
中文翻译：
Cas12a 的桥螺旋赋予顺式 DNA 切割选择性并调节反式 DNA 切割
Cas12a 是 V-A 型 CRISPR-Cas 系统的 RNA 引导 DNA 核酸内切酶，与 II 型 Cas9 蛋白趋同进化。我们之前表明，桥螺旋 (BH) 中的脯氨酸取代赋予化脓性链球菌(Spy) Cas9 中靶标 DNA 切割的选择性。在这里，我们检查了来自新杀弗朗西斯菌(FnoCas12a KD2P ) 的 Cas12a 的 BH 变体，以测试机制保守性。我们的结果表明，对于 RNA 引导的 DNA 切割（顺式活性），FnoCas12a KD2P会积累带切口的产物，同时切割具有错配的超螺旋 DNA 底物，某些错配位置对线性化更加不利。 FnoCas12a KD2P还具有降低的反式单链 DNA 切割活性。这些结果表明 BH 在顺式和反式切割中的底物选择性中发挥着重要作用，并显示了其在 Cas 核酸酶的靶标识别中的保守作用。
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