最小功能剪接调节蛋白 PTBP1 的鉴定和表征,Biochemistry

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最小功能剪接调节蛋白 PTBP1 的鉴定和表征
Biochemistry ( IF 2.9 ) Pub Date : 2020-12-07 , DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00664
Robert J Ontiveros ₁ , Luis Hernandez ₁ , Haylena Nguyen ₂ , Adrian Lino Hernandez Lopez ₃ , Archana Shankar ₁ , Enoch Kim ₁ , Niroshika M Keppetipola ₂

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聚嘧啶束结合蛋白 1 (PTBP1) 是一种经过充分研究的 RNA 结合蛋白，可作为了解替代剪接调控的分子机制的重要模型。PTBP1 有四个通过接头区域连接的 RNA 结合域 (RBD)。此外，PTBP1 有一个 N 端非结构化区域，其中包含核输入和输出序列。每个 RBD 都可以以高亲和力结合富含嘧啶的元素，以介导剪接活动。研究支持关于 PTBP1 如何介导目标外显子剪接调节的各种模型。获得详细的原子视图取决于确定与目标 RNA 转录本结合的 PTBP1 的晶体结构。在这里，我们创建了一个最小的功能性 PTBP1，在接头 1 和接头 2 区域中都有缺失，并分析了对某些受调控外显子的活性，包括 c-Src N1 外显子。我们表明，对于 PTBP1 调节的外显子的一个子集，接头区域对于剪接抑制活动不是必需的。凝胶迁移率变化分析显示，与野生型 PTBP1 相比，接头缺失突变体与目标 RNA 序列的亲和力高 12 倍。还包含 N 端区域缺失的最小 PTBP1 与目标 RNA 的结合亲和力高于野生型 PTBP1。此外，这种最小的蛋白质很容易寡聚化，形成一个独特的高级复合物，以前表明它是介导剪接抑制所必需的。这种最小的功能性 PTBP1 蛋白可以作为未来结构研究的候选者，以了解某些受调控外显子的剪接抑制机制。我们表明，对于 PTBP1 调节的外显子的一个子集，接头区域对于剪接抑制活动不是必需的。凝胶迁移率变化分析显示，与野生型 PTBP1 相比，接头缺失突变体与目标 RNA 序列的亲和力高 12 倍。还包含 N 端区域缺失的最小 PTBP1 与目标 RNA 的结合亲和力高于野生型 PTBP1。此外，这种最小的蛋白质很容易寡聚化，形成一个独特的高级复合物，以前表明它是介导剪接抑制所必需的。这种最小的功能性 PTBP1 蛋白可以作为未来结构研究的候选者，以了解某些受调控外显子的剪接抑制机制。我们表明，对于 PTBP1 调节的外显子的一个子集，接头区域对于剪接抑制活动不是必需的。凝胶迁移率变化分析显示，与野生型 PTBP1 相比，接头缺失突变体与目标 RNA 序列的亲和力高 12 倍。还包含 N 端区域缺失的最小 PTBP1 与目标 RNA 的结合亲和力高于野生型 PTBP1。此外，这种最小的蛋白质很容易寡聚化，形成一个独特的高级复合物，以前表明它是介导剪接抑制所必需的。这种最小的功能性 PTBP1 蛋白可以作为未来结构研究的候选者，以了解某些受调控外显子的剪接抑制机制。凝胶迁移率变化分析显示，与野生型 PTBP1 相比，接头缺失突变体与目标 RNA 序列的亲和力高 12 倍。还包含 N 端区域缺失的最小 PTBP1 与目标 RNA 的结合亲和力高于野生型 PTBP1。此外，这种最小的蛋白质很容易寡聚化，形成一个独特的高级复合物，以前表明它是介导剪接抑制所必需的。这种最小的功能性 PTBP1 蛋白可以作为未来结构研究的候选者，以了解某些受调控外显子的剪接抑制机制。凝胶迁移率变化分析显示，与野生型 PTBP1 相比，接头缺失突变体与目标 RNA 序列的亲和力高 12 倍。还包含 N 端区域缺失的最小 PTBP1 与目标 RNA 的结合亲和力高于野生型 PTBP1。此外，这种最小的蛋白质很容易寡聚化，形成一个独特的高级复合物，以前表明它是介导剪接抑制所必需的。这种最小的功能性 PTBP1 蛋白可以作为未来结构研究的候选者，以了解某些受调控外显子的剪接抑制机制。这种最小的蛋白质很容易寡聚形成一个独特的高阶复合物，以前证明是介导剪接抑制所必需的。这种最小的功能性 PTBP1 蛋白可以作为未来结构研究的候选者，以了解某些受调控外显子的剪接抑制机制。这种最小的蛋白质很容易寡聚形成一个独特的高阶复合物，以前证明是介导剪接抑制所必需的。这种最小的功能性 PTBP1 蛋白可以作为未来结构研究的候选者，以了解某些受调控外显子的剪接抑制机制。

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Identification and Characterization of a Minimal Functional Splicing Regulatory Protein, PTBP1

Polypyrimidine tract binding protein 1 (PTBP1) is a well-studied RNA binding protein that serves as an important model for understanding molecular mechanisms underlying alternative splicing regulation. PTBP1 has four RNA binding domains (RBDs) connected via linker regions. Additionally, PTBP1 has an N-terminal unstructured region that contains nuclear import and export sequences. Each RBD can bind to pyrimidine rich elements with high affinity to mediate splicing activity. Studies support a variety of models for how PTBP1 can mediate splicing regulation on target exons. Obtaining a detailed atomic view hinges on determining a crystal structure of PTBP1 bound to a target RNA transcript. Here, we created a minimal functional PTBP1 with deletions in both linker 1 and linker 2 regions and assayed for activity on certain regulated exons, including the c-Src N1 exon. We show that for a subset of PTBP1-regulated exons the linker regions are not necessary for splicing repression activity. Gel mobility shift assays reveal the linker deletion mutant binds with 12-fold higher affinity to a target RNA sequence compared to wild-type PTBP1. A minimal PTBP1 that also contains an N-terminal region deletion binds to a target RNA with an affinity higher than that of wild-type PTBP1. Moreover, this minimal protein oligomerizes readily to form a distinct higher-order complex previously shown to be required for mediating splicing repression. This minimal functional PTBP1 protein can serve as a candidate for future structure studies to understand the mechanism of splicing repression for certain regulated exons.

更新日期：2020-12-22

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