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Development of an Online 2D Ultrahigh-Pressure Nano-LC System for High-pH and Low-pH Reversed Phase Separation in Top-Down Proteomics.
Analytical Chemistry ( IF 6.7 ) Pub Date : 2020-08-28 , DOI: 10.1021/acs.analchem.0c03395 Zhe Wang 1 , Dahang Yu 1 , Kellye A Cupp-Sutton 1 , Xiaowen Liu 2 , Kenneth Smith 3 , Si Wu 1
Analytical Chemistry ( IF 6.7 ) Pub Date : 2020-08-28 , DOI: 10.1021/acs.analchem.0c03395 Zhe Wang 1 , Dahang Yu 1 , Kellye A Cupp-Sutton 1 , Xiaowen Liu 2 , Kenneth Smith 3 , Si Wu 1
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The development of novel high-resolution separation techniques is crucial for advancing the complex sample analysis necessary for high-throughput top-down proteomics. Recently, our group developed an offline 2D high-pH RPLC/low-pH RPLC separation method and demonstrated good orthogonality between these two RPLC formats. Specifically, ultrahigh-pressure long capillary column RPLC separation has been applied as the second dimensional low-pH RPLC separation for the improvement of separation resolution. To further improve the throughput and sensitivity of the offline approach, we developed an online 2D ultrahigh-pressure nano-LC system for high-pH and low-pH RPLC separations in top-down proteomics. An online microtrap column with a dilution setup was used to collect eluted proteins from the first dimension high-pH separation and inject the fractions for ultrahigh-pressure long capillary column low-pH RPLC separation in the second dimension. This automatic platform enables the characterization of 1000+ intact proteoforms from 5 μg of intact E. coli cell lysate in 10 online-collected fractions. Here, we have demonstrated that our online 2D pH RP/RPLC system coupled with top-down proteomics holds the potential for deep proteome characterization of mass-limited samples because it allows the identification of hundreds of intact proteoforms from complex biological samples at low microgram sample amounts.
中文翻译：
开发用于自上而下蛋白质组学中高 pH 和低 pH 反相分离的在线 2D 超高压纳米 LC 系统。
新型高分辨率分离技术的发展对于推进高通量自上而下蛋白质组学所需的复杂样品分析至关重要。最近，我们课题组开发了一种离线二维高pH RPLC/低pH RPLC 分离方法，并证明了这两种RPLC 格式之间良好的正交性。具体而言，超高压长毛细管柱RPLC分离已被应用作为第二维低pH RPLC分离，以提高分离分辨率。为了进一步提高离线方法的通量和灵敏度，我们开发了一种在线 2D 超高压纳流液相色谱系统，用于自上而下蛋白质组学中的高 pH 和低 pH RPLC 分离。使用具有稀释设置的在线微阱柱收集第一维高 pH 分离中洗脱的蛋白质，并注入组分以在第二维中进行超高压长毛细管柱低 pH RPLC 分离。该自动化平台能够对 5 μg 完整大肠杆菌细胞裂解物中 10 个在线收集的级分中的 1000 多种完整蛋白质形式进行表征。在这里，我们证明了我们的在线 2D pH RP/RPLC 系统与自上而下的蛋白质组学相结合，具有对质量有限的样品进行深度蛋白质组表征的潜力，因为它允许从低微克样品的复杂生物样品中鉴定数百种完整的蛋白质形式金额。
更新日期：2020-10-06
中文翻译：
开发用于自上而下蛋白质组学中高 pH 和低 pH 反相分离的在线 2D 超高压纳米 LC 系统。
新型高分辨率分离技术的发展对于推进高通量自上而下蛋白质组学所需的复杂样品分析至关重要。最近，我们课题组开发了一种离线二维高pH RPLC/低pH RPLC 分离方法，并证明了这两种RPLC 格式之间良好的正交性。具体而言，超高压长毛细管柱RPLC分离已被应用作为第二维低pH RPLC分离，以提高分离分辨率。为了进一步提高离线方法的通量和灵敏度，我们开发了一种在线 2D 超高压纳流液相色谱系统，用于自上而下蛋白质组学中的高 pH 和低 pH RPLC 分离。使用具有稀释设置的在线微阱柱收集第一维高 pH 分离中洗脱的蛋白质，并注入组分以在第二维中进行超高压长毛细管柱低 pH RPLC 分离。该自动化平台能够对 5 μg 完整大肠杆菌细胞裂解物中 10 个在线收集的级分中的 1000 多种完整蛋白质形式进行表征。在这里，我们证明了我们的在线 2D pH RP/RPLC 系统与自上而下的蛋白质组学相结合，具有对质量有限的样品进行深度蛋白质组表征的潜力，因为它允许从低微克样品的复杂生物样品中鉴定数百种完整的蛋白质形式金额。
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