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A novel analytical principle using AP site-mediated T7 RNA polymerase transcription regulation for sensing uracil-DNA glycosylase activity.
Analyst ( IF 3.6 ) Pub Date : 2020-05-12 , DOI: 10.1039/d0an00509f Weichen Gao 1 , Jin Xu , Guowei Lian , Xiaojun Wang , Xiaoqun Gong , Dianming Zhou , Jin Chang
Analyst ( IF 3.6 ) Pub Date : 2020-05-12 , DOI: 10.1039/d0an00509f Weichen Gao 1 , Jin Xu , Guowei Lian , Xiaojun Wang , Xiaoqun Gong , Dianming Zhou , Jin Chang
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Uracil DNA glycosylase (UDG) is a highly conserved damage repair glycosylase; the abnormal expression of DNA glycosylase has important research value in many human diseases. Therefore, highly sensitive and specific detection of UDG activity is crucial to biomedical research and clinical diagnosis. In this work, we propose an AP site-mediated T7 RNA polymerase transcription regulation analytical principle for uracil-DNA glycosylase activity analysis. T7 RNA polymerase is highly promoter-specific and only transcribes DNA downstream of the T7 promoter. We have found that modifying the T7 promoter sequence with an AP site can regulate T7 RNA polymerase transcription ability according to different modification sites. In the binding region of the promoter, AP sites greatly inhibit transcription. Moreover, AP sites in the initiation region of the promoter enhance transcription activity. Based on this research, we designed a new transcription substrate template by replacing deoxythymidine (dT) in the T7 RNA polymerase promoter sequence with one tetrahydrofuran abasic site mimic (THF) and one deoxyuridine (dU). The THF site was labeled in the transcription-enhanced region to improve transcription background, and the dU site was labeled in the transcription inhibition region to sense the UDG enzyme. In our strategy, this template can be transcribed into RNAs by T7 RNA polymerase with great multicycle amplifications. When UDG is present, dU is excised to form an AP site. The AP site damages the interaction between T7 RNA polymerase and the T7 promoter, resulting in weak transcription activity. The detection limit of this strategy is as low as 2.5 × 10−4 U mL−1, and it has good selectivity for UDG. In addition, this strategy can also detect UDG activity in complex HeLa cell lysate samples. Therefore, our developed sensor might become a promising technique for UDG activity assay.
中文翻译：
一种新颖的分析原理，使用AP位点介导的T7 RNA聚合酶转录调节来检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性。
尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）是高度保守的损伤修复糖基化酶。DNA糖基化酶的异常表达在许多人类疾病中具有重要的研究价值。因此，对UDG活性的高灵敏度和特异性检测对于生物医学研究和临床诊断至关重要。在这项工作中，我们提出了用于尿嘧啶-DNA糖基化酶活性分析的AP位点介导的T7 RNA聚合酶转录调控分析原理。T7 RNA聚合酶是高度启动子特异性的，仅转录T7启动子下游的DNA。我们已经发现，用AP位点修饰T7启动子序列可以根据不同的修饰位点调节T7 RNA聚合酶的转录能力。在启动子的结合区域，AP位点极大地抑制了转录。此外，启动子起始区域中的AP位点增强转录活性。基于这项研究，我们设计了一种新的转录底物模板，方法是用一种四氢呋喃脱碱基位模拟物（THF）和一种脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT）。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 基于这项研究，我们设计了一种新的转录底物模板，方法是用一种四氢呋喃脱碱基位模拟物（THF）和一种脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT）。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 基于这项研究，我们设计了一种新的转录底物模板，方法是用一个四氢呋喃脱碱基位模拟物（THF）和一个脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT）。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 我们通过用一个四氢呋喃无碱基位点模拟物（THF）和一个脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT），设计了一个新的转录底物模板。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 我们通过用一个四氢呋喃无碱基位点模拟物（THF）和一个脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT），设计了一个新的转录底物模板。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 dU位点被标记在转录抑制区域以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 dU位点被标记在转录抑制区域以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10-4 U mL -1，对UDG的选择性好。此外，该策略还可以检测复杂的HeLa细胞裂解液样品中的UDG活性。因此，我们开发的传感器可能成为UDG活性测定的有前途的技术。
更新日期：2020-05-12
中文翻译：
一种新颖的分析原理，使用AP位点介导的T7 RNA聚合酶转录调节来检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性。
尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）是高度保守的损伤修复糖基化酶。DNA糖基化酶的异常表达在许多人类疾病中具有重要的研究价值。因此，对UDG活性的高灵敏度和特异性检测对于生物医学研究和临床诊断至关重要。在这项工作中，我们提出了用于尿嘧啶-DNA糖基化酶活性分析的AP位点介导的T7 RNA聚合酶转录调控分析原理。T7 RNA聚合酶是高度启动子特异性的，仅转录T7启动子下游的DNA。我们已经发现，用AP位点修饰T7启动子序列可以根据不同的修饰位点调节T7 RNA聚合酶的转录能力。在启动子的结合区域，AP位点极大地抑制了转录。此外，启动子起始区域中的AP位点增强转录活性。基于这项研究，我们设计了一种新的转录底物模板，方法是用一种四氢呋喃脱碱基位模拟物（THF）和一种脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT）。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 基于这项研究，我们设计了一种新的转录底物模板，方法是用一种四氢呋喃脱碱基位模拟物（THF）和一种脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT）。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 基于这项研究，我们设计了一种新的转录底物模板，方法是用一个四氢呋喃脱碱基位模拟物（THF）和一个脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT）。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 我们通过用一个四氢呋喃无碱基位点模拟物（THF）和一个脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT），设计了一个新的转录底物模板。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 我们通过用一个四氢呋喃无碱基位点模拟物（THF）和一个脱氧尿苷（dU）代替T7 RNA聚合酶启动子序列中的脱氧胸苷（dT），设计了一个新的转录底物模板。在转录增强区标记THF位点以改善转录本底，在转录抑制区标记dU位点以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 dU位点被标记在转录抑制区域以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10 dU位点被标记在转录抑制区域以检测UDG酶。在我们的策略中，该模板可以通过T7 RNA聚合酶以极大的多周期扩增被转录为RNA。存在UDG时，将dU切除以形成AP站点。AP位点破坏T7 RNA聚合酶和T7启动子之间的相互作用，导致转录活性弱。该策略的检测极限低至2.5×10-4 U mL -1，对UDG的选择性好。此外，该策略还可以检测复杂的HeLa细胞裂解液样品中的UDG活性。因此，我们开发的传感器可能成为UDG活性测定的有前途的技术。
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