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Engineering substrate and energy metabolism for living cell production of cytidine-5'-diphosphocholine.
Biotechnology and Bioengineering ( IF 3.5 ) Pub Date : 2020-02-06 , DOI: 10.1002/bit.27291 Yanna Ren 1 , Qi Liu 1 , Haifeng Liu 2 , Xiangshan Zhou 1, 2 , Yuanxing Zhang 1, 3 , Menghao Cai 1
Biotechnology and Bioengineering ( IF 3.5 ) Pub Date : 2020-02-06 , DOI: 10.1002/bit.27291 Yanna Ren 1 , Qi Liu 1 , Haifeng Liu 2 , Xiangshan Zhou 1, 2 , Yuanxing Zhang 1, 3 , Menghao Cai 1
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Cytidine-5'-diphosphocholine (CDP-choline) is a widely used neuroprotective drug for multiple indications. In industry, CDP-choline is synthesized by a two-step cell culture/permeabilized cell biotransformation method because substrates often do not enter cells in an efficient manner. This study develops a novel one-step living cell fermentation method for CDP-choline production. For this purpose, the feasibility of Pichia pastoris as a chassis was demonstrated by substrate feeding and CDP-choline production. Overexpression of choline phosphate cytidylyltransferase and choline kinase enhanced the choline transformation pathway and improved the biosynthesis of CDP-choline. Furthermore, co-overexpression of ScHnm1, which is a heterologous choline transporter, highly improved the utilization of choline substrates, despite its easy degradation in cells. This strategy increased CDP-choline titer by 55-folds comparing with the wild-type (WT). Overexpression of cytidine-5'-monophosphate (CMP) kinase and CDP kinase in the CMP transformation pathway showed no positive effects. An increase in the ATP production by citrate stimulation or metabolic pathway modification further improved CDP-choline biosynthesis by 120%. Finally, the orthogonal optimization of key substrates and pH was carried out, and the resulting CDP-choline titer (6.0 g/L) at optimum conditions increased 88 times the original titer in the WT. This study provides a new paradigm for CDP-choline bioproduction by living cells.
中文翻译：
工程底物和能量代谢，用于活细胞生成5'-二磷酸胆碱。
胞苷5'-二磷酸胆碱（CDP-胆碱）是一种广泛用于多种适应症的神经保护药。在工业上，CDP-胆碱是通过两步细胞培养/透化细胞生物转化方法合成的，因为底物通常不会以有效的方式进入细胞。这项研究开发了一种新型的一步法活细胞发酵方法来生产CDP-胆碱。为此，通过底物进料和CDP-胆碱生产证明了巴斯德毕赤酵母作为底盘的可行性。胆碱磷酸胞嘧啶转移酶和胆碱激酶的过表达增强了胆碱转化途径并改善了CDP-胆碱的生物合成。此外，异源胆碱转运蛋白ScHnm1的共过量表达大大提高了胆碱底物的利用率，尽管它在细胞中容易降解。与野生型（WT）相比，该策略可将CDP-胆碱效价提高55倍。CMP转化途径中胞苷5'-单磷酸（CMP）激酶和CDP激酶的过表达未显示积极作用。通过柠檬酸盐刺激或代谢途径修饰而增加的ATP产量使CDP-胆碱的生物合成进一步提高了120％。最后，对关键底物和pH值进行正交优化，在最佳条件下所得的CDP-胆碱效价（6.0 g / L）增加了WT原始效价的88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。CMP转化途径中的单磷酸（CMP）激酶和CDP激酶未显示积极作用。通过柠檬酸盐刺激或代谢途径修饰而增加的ATP产量使CDP-胆碱的生物合成进一步提高了120％。最后，对关键底物和pH值进行正交优化，在最佳条件下所得的CDP-胆碱效价（6.0 g / L）增加了WT原始效价的88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。CMP转化途径中的单磷酸（CMP）激酶和CDP激酶未显示积极作用。通过柠檬酸盐刺激或代谢途径修饰而增加的ATP产量使CDP-胆碱的生物合成进一步提高了120％。最后，对关键底物和pH值进行正交优化，在最佳条件下所得的CDP-胆碱效价（6.0 g / L）增加了WT原始效价的88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。0 g / L）在最佳条件下将WT中的原始滴度提高了88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。0 g / L）在最佳条件下将WT中的原始滴度提高了88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。
更新日期：2020-04-09
中文翻译：
工程底物和能量代谢，用于活细胞生成5'-二磷酸胆碱。
胞苷5'-二磷酸胆碱（CDP-胆碱）是一种广泛用于多种适应症的神经保护药。在工业上，CDP-胆碱是通过两步细胞培养/透化细胞生物转化方法合成的，因为底物通常不会以有效的方式进入细胞。这项研究开发了一种新型的一步法活细胞发酵方法来生产CDP-胆碱。为此，通过底物进料和CDP-胆碱生产证明了巴斯德毕赤酵母作为底盘的可行性。胆碱磷酸胞嘧啶转移酶和胆碱激酶的过表达增强了胆碱转化途径并改善了CDP-胆碱的生物合成。此外，异源胆碱转运蛋白ScHnm1的共过量表达大大提高了胆碱底物的利用率，尽管它在细胞中容易降解。与野生型（WT）相比，该策略可将CDP-胆碱效价提高55倍。CMP转化途径中胞苷5'-单磷酸（CMP）激酶和CDP激酶的过表达未显示积极作用。通过柠檬酸盐刺激或代谢途径修饰而增加的ATP产量使CDP-胆碱的生物合成进一步提高了120％。最后，对关键底物和pH值进行正交优化，在最佳条件下所得的CDP-胆碱效价（6.0 g / L）增加了WT原始效价的88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。CMP转化途径中的单磷酸（CMP）激酶和CDP激酶未显示积极作用。通过柠檬酸盐刺激或代谢途径修饰而增加的ATP产量使CDP-胆碱的生物合成进一步提高了120％。最后，对关键底物和pH值进行正交优化，在最佳条件下所得的CDP-胆碱效价（6.0 g / L）增加了WT原始效价的88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。CMP转化途径中的单磷酸（CMP）激酶和CDP激酶未显示积极作用。通过柠檬酸盐刺激或代谢途径修饰而增加的ATP产量使CDP-胆碱的生物合成进一步提高了120％。最后，对关键底物和pH值进行正交优化，在最佳条件下所得的CDP-胆碱效价（6.0 g / L）增加了WT原始效价的88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。0 g / L）在最佳条件下将WT中的原始滴度提高了88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。0 g / L）在最佳条件下将WT中的原始滴度提高了88倍。这项研究为活细胞CDP-胆碱生物生产提供了新的范例。
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