3-Deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (Kdo) is an essential component of LPS in the outer leaflet of the Gram-negative bacterial outer membrane. Although labeling of Escherichia coli with the chemical reporter 8-azido-3,8-dideoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (Kdo-N3) has been reported, its incorporation into LPS has not been directly shown. We have now verified Kdo-N3 incorporation into E. coli LPS at the molecular level. Using microscopy and PAGE analysis, we show that Kdo-N3 is localized to the outer membrane and specifically incorporates into rough and deep-rough LPS. In an E. coli strain lacking endogenous Kdo biosynthesis, supplementation with exogenous Kdo restored full-length core-LPS, which suggests that the Kdo biosynthetic pathways might not be essential in vivo in the presence of sufficient exogenous Kdo. In contrast, exogenous Kdo-N3 only restored a small fraction of core LPS with the majority incorporated into truncated LPS. The truncated LPS were identified as Kdo-N3-lipid IVA and (Kdo-N3)2-lipid IVA by MS analysis. The low level of Kdo-N3 incorporation could be partly explained by a 6-fold reduction in the specificity constant of the CMP-Kdo synthetase KdsB with Kdo-N3 compared with Kdo. These results indicate that the azido moiety in Kdo-N3 interferes with its utilization and may limit its utility as a tracer of LPS biosynthesis and transport in E. coli We propose that our findings will be helpful for researchers using Kdo and its chemical derivatives for investigating LPS biosynthesis, transport, and assembly in Gram-negative bacteria.

中文翻译：

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叠氮基3,8-二脱氧-d-甘露聚糖-辛-2-磺酸的分子表征和验证。

3-Deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid（Kdo）是革兰氏阴性细菌外膜外小叶中LPS的重要成分。尽管已经报道了用化学报告分子8-叠氮基-3，8-二脱氧-d-甘露聚糖-辛-2-核糖酸（Kdo-N3）标记大肠杆菌，但没有直接显示其掺入LPS。现在，我们已经在分子水平上验证了Kdo-N3掺入大肠杆菌LPS的能力。使用显微镜和PAGE分析，我们显示Kdo-N3定位在外膜上，并特别结合到粗糙和深-粗糙LPS中。在缺乏内源性Kdo生物合成的大肠杆菌菌株中，补充外源性Kdo可以恢复全长核心-LPS，这表明在存在足够的外源性Kdo的情况下，体内Kdo的生物合成途径可能不是必需的。相比之下，外源性的Kdo-N3仅还原了核心LPS的一小部分，大部分被整合到截短的LPS中。截短的LPS通过MS分析鉴定为Kdo-N3-脂质IVA和（Kdo-N3）2-脂质IVA。Kdo-N3掺入量低的部分原因是，与Kdo相比，带有Kdo-N3的CMP-Kdo合成酶KdsB的特异性常数降低了6倍。这些结果表明，Kdo-N3中的叠氮基部分会干扰其利用，并可能限制其作为LPS生物合成和在大肠杆菌中运输的示踪剂的作用。我们建议，我们的发现对使用Kdo及其化学衍生物进行研究的研究人员会有所帮助LPS在革兰氏阴性细菌中的生物合成，运输和组装。截短的LPS通过MS分析鉴定为Kdo-N3-脂质IVA和（Kdo-N3）2-脂质IVA。Kdo-N3掺入量低的部分原因是，与Kdo相比，带有Kdo-N3的CMP-Kdo合成酶KdsB的特异性常数降低了6倍。这些结果表明，Kdo-N3中的叠氮基部分会干扰其利用，并可能限制其作为LPS生物合成和在大肠杆菌中运输的示踪剂的作用。我们建议，我们的发现对使用Kdo及其化学衍生物进行研究的研究人员会有所帮助LPS在革兰氏阴性细菌中的生物合成，运输和组装。截短的LPS通过MS分析鉴定为Kdo-N3-脂质IVA和（Kdo-N3）2-脂质IVA。Kdo-N3掺入量低的部分原因是，与Kdo相比，带有Kdo-N3的CMP-Kdo合成酶KdsB的特异性常数降低了6倍。这些结果表明，Kdo-N3中的叠氮基部分会干扰其利用，并可能限制其作为LPS生物合成和在大肠杆菌中运输的示踪剂的作用。我们建议，我们的发现对使用Kdo及其化学衍生物进行研究的研究人员会有所帮助LPS在革兰氏阴性细菌中的生物合成，运输和组装。Kdo-N3掺入量低的部分原因是，与Kdo相比，带有Kdo-N3的CMP-Kdo合成酶KdsB的特异性常数降低了6倍。这些结果表明，Kdo-N3中的叠氮基部分会干扰其利用，并可能限制其作为LPS生物合成和在大肠杆菌中运输的示踪剂的作用。我们建议，我们的发现对使用Kdo及其化学衍生物进行研究的研究人员会有所帮助LPS在革兰氏阴性细菌中的生物合成，运输和组装。Kdo-N3掺入量低的部分原因是，与Kdo相比，带有Kdo-N3的CMP-Kdo合成酶KdsB的特异性常数降低了6倍。这些结果表明，Kdo-N3中的叠氮基部分会干扰其利用，并可能限制其作为LPS在大肠杆菌中生物合成和运输的示踪剂。 LPS在革兰氏阴性细菌中的生物合成，运输和组装。