东南大学梁高林教授团队JACS：单细胞酶活空间定量成像

细胞在生化状态、功能或命运上表现出显著异质性，而酶活性是驱动此异质性的重要因素之一。因此，在单细胞水平上对酶活性进行空间定量成像具有重要意义。在众多酶活检测方法中，拉曼成像作为一种新兴的光学成像技术，凭借其高时空分辨率、无光漂白以及低自发荧光等优势，被认为是极具潜力的酶活检测方法。通过探测探针分子拉曼散射信号变化，拉曼成像能够在微观尺度上精准定位酶活性位点，适用于活细胞中酶催化过程的可视化追踪。然而，现有的拉曼探针普遍存在细胞内停留时间短和缺乏内参照物的局限性，难以实现单个活细胞内酶活的空间定量成像，限制了对细胞异质性的深入解析。

基于此，东南大学梁高林教授（点击查看介绍）团队以肿瘤细胞内高表达的组织蛋白酶B（CTSB）为例，设计了一种比率型拉曼探针Val-Cit-Cys(StBu)-Pra-Gly-CBT (Yne-CBT)，对单细胞内CTSB酶活进行了空间定量成像（图1）。该探针包含三个关键部分：（1）CTSB特异性识别的多肽底物序列Val-Cit；（2）带有氰基的CBT和StBu保护的Cys，用于CBT-Cys点击反应；（3）含有炔丙基的甘氨酸。当Yne-CBT被细胞摄取后，被CTSB特异性酶切，触发CBT-Cys点击反应，生成环状二聚体Yne-CBT-Dimer，从而延长探针在胞内的停留时间。在Yne-CBT发生CBT-Cys点击反应过程中，氰基被消耗，其拉曼信号随之降低；炔基的拉曼信号不变，可作为内参。通过结合壳层隔绝纳米颗粒增强拉曼光谱（SHINERS）技术，对炔基和氰基的拉曼信号进行比率型成像，可以定量检测出活细胞内不同部位的CTSB酶活。

图1. 比率型拉曼探针Yne-CBT结合SHINERS技术用于单细胞内CTSB酶活空间定量成像示意图。

首先，作者合成了用于SHINERS的Au@SiO₂纳米颗粒，其SiO₂壳层厚度约3 nm，总体尺寸约33 nm（图2a, b）。超薄SiO₂壳层能够有效隔绝胞内生物分子对Au的吸附，从而保证后续增强拉曼信号的稳定性和检测有效性。随后，作者体外验证了Yne-CBT探针对CTSB的响应性和定量检测性能。通过高效液相色谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析，验证了Yne-CBT探针在CTSB的酶切作用下发生CBT-Cys点击反应，生成环状二聚体Yne-CBT-Dimer（图2c, d）。当加入Au@SiO₂纳米颗粒后，Yne-CBT分子上的炔基和氰基分别位于2120 cm^-1和2227 cm^-1的拉曼信号得到显著增强（图3a）。与不同浓度 CTSB 孵育后，其相对拉曼强度（(I₂₁₂₀-I₂₂₂₇)/I₂₁₂₀）与CTSB浓度呈线性关系，检测限为61.4 U L^-1（图3b, c）。以上结果表明，CTSB介导的CBT-Cys点击反应中，Yne-CBT探针的氰基被消耗，炔基不受影响，其相对强度可用于定量检测CTSB活性。

图2. Au@SiO₂纳米颗粒的表征及Yne-CBT探针对CTSB酶切过程的分析。

图3. Yne-CBT探针结合SHINERS技术对CTSB的定量检测分析。

随后，作者自制了微流控通道，并将Yne-CBT成功应用于单个MDA-MB-231活细胞中CTSB酶活的空间定量成像。结果显示，炔基和氰基的比率信号随着孵育时间的延长逐渐增加，表明CBT-Cys点击反应的进行及环状二聚体Yne-CBT-Dimer的产生。该二聚体的产生显著延长了探针在胞内的滞留时间（图4）。通过将比率拉曼成像图转化成酶活热图，能够直观地发现胞内不同区域CTSB酶活存在显著差异（图5）。该工作为高精度单细胞分析提供了一种简单却实用的工具，并为研究细胞异质性和酶介导的生物过程提供了一种新的成像方法。

图4. 活细胞原位拉曼成像微流控系统搭建与单细胞CTSB酶活定量成像图。

图5. 单细胞CTSB酶活热图。

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上。论文的共同第一作者为东南大学生物科学与医学工程学院王睿研究员和中国药科大学理学院周磊副教授。东南大学首席教授、数字医学工程全国重点实验室副主任梁高林为唯一通讯作者。该工作在国家重点研发计划、国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金青年项目和江苏省前沿引领技术基础研究重大项目的资助下完成。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Spatially Quantitative Imaging of Enzyme Activity in a Living Cell

Rui Wang^§, Lei Zhou^§, Yueyan Yang, Furong Zhao, Xianbao Sun, Xiaoyang Liu, Zhen Zou, and Gaolin Liang*

J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c14190

通讯作者信息

梁高林，男，1972年9月15日出生，江苏兴化人，东南大学首席教授，数字医学工程全国重点实验室副主任，博士生导师，国家杰出青年科学基金获得者，民建中央科教委员会副主任。1989年考入南京大学基础学科教学强化部（理科第一名）。1993年获南京大学物理化学专业学士，2002年郑州大学化学工艺专业硕士，2005年复旦大学药物化学专业博士。1993年至2002年，江苏省原子医学研究所助理研究员。2005年9月至2008年1月香港科技大学化学系博士后，导师徐兵教授。2008年1月至2010年5月，美国斯坦福大学医学院博士后，导师饶江洪教授。主要从事分子与细胞显像的研究。2010年3月受聘为中国科技大学教授，2018年12月被聘为东南大学教授，博士生导师。迄今为止，在SCI收录期刊上发表论文200余篇。其中大部分在Nature Chemistry, Nature Communications, Science Advances, Journal of the American Chemical Society, Angewandte Chemie International Edition, Advanced Materials, Nano Letters, ACS Nano, Advanced Science, Advanced Functional Materials, Analytical Chemistry等国际期刊上发表，论文目前被引用11000余次，H因子55。主持或参与科技部国家重点研发计划3项、基金委创新研究群体项目1项、国家杰出青年科学基金1项、基金委重点等项目6项、江苏省前沿引领技术基础研究专项1项；先后获得国家二类新药证书1项、中国专利12项、世界专利1项，美国专利1项。获2020年国务院政府特殊津贴、入选2019年国家百千万人才工程，被授予“有突出贡献中青年专家”、获2019年安徽省自然科学二等奖（排名第一）、2017年“国家杰出青年科学基金”资助、2010年教育部“新世纪优秀人才支持计划”。

https://www.x-mol.com/university/faculty/14777