湖南大学黄晋Adv. Sci.：顺序激活的智能DNA纳米球用于光免疫疗法和免疫检查点阻断

由于癌细胞固有的免疫抑制和免疫逃避，将光免疫疗法与免疫检查点阻断相结合，利用光疗和免疫增强，克服相互限制并显示出显著的抗癌潜力。主要挑战包括药物的非特异性积累、不受控制的激活和药物载体的安全性。近期，湖南大学化学化工学院黄晋教授（点击查看介绍）课题组开发了一种能够顺序激活的智能DNA纳米球，用于光免疫治疗和免疫检查点阻断。这项研究拓宽了DNA纳米材料在精准药物递送和肿瘤治疗中的应用。相关研究成果发表在Advanced Science，论文的第一作者为博士研究生陈余，通讯作者为湖南大学化学化工学院黄晋教授。

图1. NS-Ce6-PDL1的组装过程及其在癌症光免疫治疗和免疫检查点阻断中的协同作用。

与化疗或放疗相比，光疗具有选择性高、副作用小、局部治疗、诱导免疫原性细胞死亡（ICD）增强免疫应答等优点。然而，由于肿瘤细胞固有的免疫抵抗或免疫逃逸能力，彻底根除肿瘤具有挑战性，且远处转移的风险增加。因此，单纯依靠光疗未必能达到最佳治疗效果。因此，结合光疗和免疫检查点阻断（ICB）可能可以增强整体抗肿瘤效果。目前存在的问题是，针对ICB的抗体疗法仅阻断细胞膜表面的检查点，但细胞内蛋白的持续表达可能补偿免疫检查点，导致阻断失败和耐药。并且治疗剂的非特异性积累、不受控激活可能会降低疗效并导致毒性增加。本文的解决思路是使用siRNA疗法，降低整个细胞的靶点，减少耐受性的产生，另外利用DNA纳米材料的优势开发靶向、响应激活的核酸纳米药物递送系统，用于光免疫治疗疗和免疫检查点阻断的协同治疗，实现强大的肿瘤抑制作用。

实验原理如图1所示，DNA纳米球（NS）是通过Y形DNA单体（Y）和连接DNA单体（L）之间的粘性末端逐步杂交自组装形成的。将i-motif序列和PD-L1 siRNA合理编程到L中，光敏剂（chlorin e6、Ce6）和荧光淬灭剂（BHQ2）分别偶联到Y和L的适当位点。当Y和L自组装时，光敏剂由于靠近淬灭剂被淬灭。为了增强靶向能力，通过DNA杂交将广谱肿瘤特异性适配体（AS1411）锚定在NS上。静脉注射后，NS通过适配体靶向被癌细胞特异性摄取。NS能够响应溶酶体中的酸性环境，导致i-motif的构象变化，NS会解组装并从溶酶体中逃逸。这导致光敏剂和淬灭剂的空间分离，在激光照射下产生单线态氧（¹O₂），不仅杀死肿瘤细胞，还诱导癌细胞ICD。ICD释放高迁移率族蛋白1（HMGB1）和钙网蛋白（CRT）等信号分子，募集树突状细胞（DC）呈递肿瘤相关抗原（TAAs），并激活T细胞，从而启动免疫攻击。同时，RNase H介导的siRNA释放可以下调癌细胞中PD-L1的表达，降低免疫耐受和逃逸，从而增强免疫治疗的有效性。因此，光疗和免疫疗法的协同作用可以有效地杀死癌细胞，而NS的靶向和可控激活可以最大限度地减少对正常组织的毒副作用。

图2. NS的自组装和解组装。

作者首先对NS的自组装和解组装进行了研究，如图2b所示，琼脂糖凝胶电泳验证了NS的逐步组装过程。动态光散射分析显示NS的平均粒径约为141 nm（图2c）。透射电子显微镜（图2d）和扫描电子显微镜（图2e）显示NS呈球形且相对均匀。接着探究了酸和RNase H介导的NS解组装（图2f）。结果表明，NS在酸性条件下可以形成i-motif结构（图2g），粒径减小（图2h），荧光恢复（图2i），产生单线态氧（图2j）。随后，对RNase H介导的NS解组装进行了研究，结果表明，NS在RNase H的介导下可解组装，释放siRNA，且解组装是RNase H浓度依赖和时间依赖的（图2k-m）。上述结果表明，在酸和RNase H存在下，NS可以解组装以激活光敏剂和释放PD-L1 siRNA。

图3. 细胞摄取和溶酶体逃逸。

接下来研究了NS的细胞摄取途径。结果表明，NS的细胞摄取是一个能量依赖性过程，依赖于巨胞饮、网格蛋白介导的内吞和小窝介导的内吞（图3a-d）。内吞作用途径表明NS可以通过溶酶体途径易位到细胞质中。随后进行了NS的溶酶体逃逸分析，结果表明，NS可以由溶酶体中逃逸至细胞质以避免溶酶体中的酶促降解（图3e-f）。另外，NS和NS_c与细胞孵育相同时间后，结果显示，NS的激活程度显著高于NS_c（图3g-h）。

图4. 体外癌细胞杀伤作用。

进一步评估了NS在细胞内的¹O₂产生和PD-L1沉默效果，结果表明NS-Ce6和NS-Ce6-PDL1组处理的细胞在激光照射后产生明显的¹O₂（图4a-b）。RT-qPCR、WB和免疫荧光结果表明NS-PDL1和NS-Ce6-PDL1组的细胞内PD-L1表达显著下调（图4c-f）。细胞活力结果显示在激光照射下，NS-Ce6-PDL1以剂量依赖性方式显著诱导细胞死亡（图4g）。随后细胞活力、活/死细胞染色和细胞凋亡结果表明NS-Ce6-PDL1组表现出最强的癌细胞杀伤效果（图4h-k）。为了研究NS-Ce6-PDL1在沉默PD-L1表达和诱导光毒性癌细胞杀伤中的普适性，使用小鼠来源的乳腺癌细胞（4T1）进行了类似的实验。结果表明，NS-Ce6-PDL1同样可以在4T1癌细胞中产生ROS、下调PD-L1表达，发挥有效的癌细胞杀伤作用（图4l-n）。

图5. 体外诱导免疫原性细胞死亡。

NS-Ce6-PDL1处理的肿瘤细胞暴露在激光下以产生¹O₂，除了直接杀死肿瘤细胞外，它还可以通过诱导ICD来进一步触发免疫反应（图5a）。在此过程中，光疗杀死的肿瘤细胞可以释放TAAs和损伤相关分子模式（DAMP）。DAMP充当刺激免疫系统的“危险”信号，诱导DC成熟。它促进DC呈递TAAs和T细胞的激活，从而启动细胞毒性T细胞（CD8⁺）对肿瘤细胞的攻击。为了评估NS-Ce6-PDL1在癌细胞中诱导ICD的能力，检测了关键DAMP的释放或暴露，包括CRT和HMGB1。结果表明，在MCF-7细胞和4T1细胞中，PDT介导的细胞杀伤诱导了CRT和HMGB1的释放，证实了PDT介导的免疫原性细胞死亡的发生（图5b-i）。

图6. 体外促进T细胞活化和杀伤。

为了研究NS介导的siRNA释放是否可以沉默PD-L1表达，从而促进T细胞活化和癌细胞杀伤，对癌细胞和T细胞进行了体外共培养实验。如图6a所示，设置了四组：第1组仅由活化的T细胞组成，可以释放大量的白细胞介素-2（IL-2），并作为对照。第2组、第3组和第4组是分别用PBS、NS和NS-PDL1预处理的癌细胞，然后与活化的T细胞共培养。这些预处理导致不同程度的T细胞活化和IL-2释放。作者测量了两种共培养模型（MCF-7和Jurkat、4T1和CTLL-2）中的IL-2水平以评估T细胞活化。结果显示共培养之后的T细胞中的的IL-2水平降低，但这种降低可以通过肿瘤细胞的NS-PDL1处理来逆转（图6b-c）。为了评估NS-PDL1对T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的影响，进行了细胞凋亡分析，结果显示两组共培养模型中，NS-PDL1处理后的癌细胞中的细胞凋亡率最高（图6d-g)。这些结果表明，NS-PDL1通过下调癌细胞中的PD-L1来逆转免疫抑制，从而促进T细胞活化并增强T细胞抗肿瘤活性。

图7.体内协同抗肿瘤免疫。

接下来，在4T1荷瘤小鼠模型中监测关键免疫细胞，以研究基于NS-Ce6-PDL1的免疫疗法的协同效应（图7a）。ICD诱导的TAAs可被未成熟的DC摄取和吞噬，导致DC成熟。随后，成熟的DC将TAAs呈递给淋巴结中的T细胞，并激活T细胞。因此，在注射不同制剂后，我们检测了4T1荷瘤小鼠的腹股沟淋巴结的成熟DC的频率（图7b-c）。结果显示，NS-Ce6-PDL1组表现出最高的DC成熟频率。这说明与单一疗法相比，联合疗法显著促进了DC成熟。T细胞活化后，CD8⁺可浸润肿瘤组织，并通过分泌干扰素γ（IFN-γ）、颗粒酶和穿孔素等有毒细胞因子杀死肿瘤细胞。因此，我们进一步提取肿瘤浸润淋巴细胞，测量浸润的CD8⁺细胞（图7d-e）和CD8⁺ T细胞中IFN-γ的表达（图7f-g）。结果显示，联合治疗组（NS-Ce6 -PDL1）肿瘤组织中CD8⁺细胞和CD8⁺/IFN-γ+双阳性T细胞的频率显著高于其他治疗组。这些结果表明，与单一疗法相比，基于NS的PIT/ICB联合疗法可以诱导更强的免疫反应，表明其具有增强抗肿瘤疗效的潜力。

图8. 体内协同抗肿瘤作用。

最后在4T1荷瘤小鼠体内研究协同肿瘤治疗效果，结果显示，在治疗期间小鼠的体重没有显著变化，表明不同的制剂在生物学上是安全的（图8b）。肿瘤生长曲线（图8c-d）、肿瘤质量（图8e）结果显示，联合治疗组显示出最好的肿瘤抑制效果，肿瘤消除率达到65%（图8f）。随后，对肿瘤切片进行了组织化学分析，结果显示联合治疗在肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞杀伤和PD-L1表达下调方面均表现出显著优势（图8h-i）。这些结果表明，NS-Ce6-PDL1显著增强抗肿瘤免疫反应，协同提高抗肿瘤疗效。

相关研究成果发表在Advanced Science，论文的第一作者为博士研究生陈余，通讯作者为湖南大学化学化工学院黄晋教授。该研究工作得到国家自然科学基金和湖南省自然科学基金的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Sequentially activated smart DNA nanospheres for photoimmunotherapy and immune checkpoint blockade

Yu Chen, Yu Guo, Wen Chen, Jiahao Fan, Jiacheng Li, Jiajia Song, Xiaohai Yang, Kemin Wang, Jin Huang*

Adv. Sci., 2024, DOI: 10.1002/advs.202410632

研究团队简介

黄晋，湖南大学化学化工学院教授，博士生导师，教育部青年长江学者，湖南省杰出青年基金获得者，湖南大学岳麓学者。研究兴趣是DNA纳米材料及其生物医学应用。先后主持和参与国家及省部级科研项目近20项，已在国际学术期刊上发表论文200余篇，总引用次数超过10000次（H因子55），获发明专利8项。

https://www.x-mol.com/university/faculty/66377