Chem Catal.：级联反应实现C-核苷的生物催化合成

C-核苷作为抗感染药剂以及治疗性核酸的组成砌块，是一类重要的合成目标分子。然而，已报道的C-核苷合成方法面临原料来源受限、产率低、反应范围小等挑战。针对该难题，来自奥地利格拉茨工业大学的Bernd Nidetzky教授研究团队近日在Cell Press细胞出版社旗下期刊Chem Catalysis 上发表研究论文，发展了一种基于磷酸化-缩合的级联反应策略，利用D-核糖（Rib）以及尿嘧啶作为原料制备假尿苷5'-磷酸（Ψ5P）。级联过程包括Rib在偶联激酶催化下于O5位发生磷酸化生成Rib5P中间体，并进一步与等摩尔当量尿嘧啶缩合定量转为Ψ5P。借助于条件优化，该反应可实现Ψ5P的克级别合成，并在多元酶促级联反应用于高效制备C-核苷类似物方面展现出优异的合成兼容性。

研究亮点

• 低成本：磷酸化-缩合级联反应合成Ψ5P利用Rib和尿嘧啶原料，来源广泛、成本低廉。

• 高性能：通过偶联激酶和C-糖苷酶，实现了Ψ5P一锅法合成，产率接近定量，且具有较高的空间和化学选择性。

• 可放大：结合生物催化和反应工程，优化条件，显著提高了Ψ5P合成效率，实现宏量制备。

• 可兼容：一锅法将多类五碳糖和尿嘧啶类似物原料合成相应的C-核苷类似物。

研究背景

假尿苷（Ψ）是尿苷（U）的天然C-糖苷异构体，存在于多种RNA类型中（图1A）。Ψ及其1-N-甲基衍生物是合成RNA的构建砌块，可应用于mRNA治疗技术中。RNA治疗技术的发展使得对Ψ的需求不断增长，学界和产业界对其合成的关注也随之增加。尽管已有多种化学合成Ψ的方法，但仍存在立体选择性、效率和步骤经济性等方面的挑战。在水作为溶剂时Ψ5P的合成已实现定量，因而实现Ψ5P合成反应的主要挑战在于高效制备Rib5P底物用于C-糖苷酶的酶促反应（图1B）。尽管目前已有研究关注Rib5P的合成，但多反应步骤互不兼容，难以实现一锅反应；此外合成原料来源受限，经济性堪忧。例如，利用U与α-D-核糖-1-磷酸盐反应得到Rib5P并进一步转化为Ψ5P，优化条件下具有高产率（~100%）、高产物浓度（~320 g/L）、高产量（~40 g/L/h）和产物纯度（≥ 95%）等优点（图1C）。然而，U并非成熟的商业原料。在此背景下，利用方便可得的Rib和Ura作为原料则可降低Ψ5P的生产成本。

图1. Ψ5P的酶催化合成

基于以上分析，作者系统评估了以五碳糖和尿嘧啶类似物为原料进行磷酸化-缩合级联反应的各个步骤。针对磷酸化反应，考察了磷酸酶和激酶催化的反应，讨论并确认了乙酰磷酸（AcP）作为磷酸供体的有效性。进一步地，通过生物催化与反应工程的结合，将磷酸化反应和缩合反应成功集成，一锅法高效合成Ψ5P。该过程的反应边界远远超出（30倍）了核碱基可溶性底物浓度的极限，并最大限度地利用了AcP供体。除此之外，多种N-核苷也通过磷酸化-缩合级联反应得以合成。

结果与讨论

1. 磷酸化反应合成Rib5P

首先，作者尝试了由磷酸酶催化的磷酸化反应，采用多种生物来源的磷酸酶，借助AcP作为磷酸供体底物进行研究。然而，产物的核磁共振NMR图谱结果显示，当AcP完全转化时，D-核糖-1-磷酸盐与Rib5P的产量相近，表明磷酸酶催化的Rib磷酸化反应不具有选择性，这可能是由于磷酸酶缺乏对Rib的位点选择性（图2A）。随后，作者选取对Rib O5位点具有选择性的RbsK反应合成Rib5P，并偶联AcK反应实现ATP的再生（图1D）。该反应通过激酶催化，在水相pH 7.5和30°C的条件下进行，ATP将Rib磷酸化，以高产率（≥ 90%）得到Rib5，该条件是两种激酶和C-糖苷酶的综合最适条件（图2B）。

图2. Rib磷酸化反应的筛选：使用磷酸酶或激酶的对应反应效率

在确认偶联激酶反应为实现磷酸化的有效反应类型后，作者进一步通过调整底物浓度以及Mg²⁺浓度（反应所使用两种激酶的辅因子），将磷酸化反应的效率显著提高。当Rib浓度调整至~ 1M时，其转化率高达约97%（图3A）；而当调节Mg²⁺至接近其饱和浓度（~ 60 mM）时，Rib5P的生成速率提升了约20倍。值得注意的是，尽管AcK和RbsK在反应中逐渐失活，但通过反应的快速转化可最小化酶失活带来的影响。在优化条件下，Rib5P的生产速率可达150 g/L/h，且基于质量的总转化数超过1.5×10² g/g（图3B）。

图3. 优化耦合RbsK和AcK反应实现Rib5P高效合成

2. 酶催化C-C缩合实现Ψ5P合成的反应工程

在优化Rib经磷酸化合成Rib5P反应后，作者紧接着对级联反应中涉及的C-C缩合进行系统探究。研究中使用来自于大肠杆菌的C-糖苷酶YeiN，该酶在Rib5P反应体系中可维持其反应活性，无需额外添加Mn²⁺就可实现Rib5P与Ura的C-C缩合反应。考虑到Ura在水中的溶解度是反应中所使用Rib5P浓度的约1/30，研究人员采取分步加入Ura的投料策略，单次投入量在50-670 mM之间，并施加搅拌以联合克服溶解和传质限制。通过调节使用YeiN酶的浓度，使Ura与Rib5P缩合转化生成Ψ5P的产率超过97%，产量高达52 g/L/h（图4）。

图4. 固体Ura存在条件下对Ψ5P生产的强化

3. 一锅法反应的放大 

随后，作者将一锅法反应量级从0.5 mL扩大20倍至10 mL量级（图5），发现无论是顺序反应还是同时反应，级联反应中的磷酸化步骤与缩合步骤均可兼容，但由于同时反应条件下YeiN的活性受到碱性环境的影响使得产率下降约30%（图6）。优化条件下，在10 mL反应体积中可获得约2.2 g的Ψ5P，产量可达到38 g/L/h。

图5. 用于合成Ψ5P的磷酸化-缩合级联反应的放大化

图6. 同时反应模式下Ψ5P生产涉及的磷酸化与缩合反应的反应-时间曲线

4. 级联反应的合成灵活性与实际价值

对于各类五碳糖，如D-阿拉伯糖（Ara）、2-脱氧-Rib（2dRib）和D-木糖（Xyl）等，以及尿嘧啶类似物（如6-氨基、2-硫、4-硫等）原料，作者通过优化条件展示了所开发的级联合成反应在通过五碳糖和Ura类似物为原料构筑核苷反应中的合成灵活性。值得注意的是，尽管YeiN酶对五碳糖的结构变化的敏感性较高，但仍然能够在合适的浓度条件下合成具有良好产率的C-核苷酸5'-磷酸类似物（表1）。

表1. 五碳糖磷酸化反应以及C-核苷酸5'-磷酸类似物合成反应性能总结

5. 生物催化级联反应的比较

该论文研究的关键问题是此前报道的Ψ5P级联合成路径中使用的U原料是否能被更常见易得的原料（即Rib/Ura）所取代，同时保持合成路径的效率。而开发以Rib/Ura为原料的合成路径的主要挑战在于要高效地实现O5位选择性的Rib磷酸化反应。因此，作者比较了以Rib/Ura为原料和文献中报道的以U为原料合成Ψ5P的两种级联反应（表2），发现尽管两者的产率都很高，但从Rib/Ura原料级联反应中获得的Ψ5P产品浓度较低，这是由于AcP的可用浓度限制和pH控制引起的稀释所致。此外，两种路线的周转数相似。而就可比较的酶蛋白总用量而言，本工作报道的以Rib/Ura为反应原料的Ψ5P生产路径则具有更高的产量。同时，作者指出，将酶循环使用或提高其反应稳定性是提升总周转数的有效策略。例如，使用AcK的热稳定性变异体僵尸未来探究的选项之一。两种级联合成路径的产物纯度也有所区别。具体而言，Rib/Ura原料级联转化路径得到的Ψ5P产品浓度约为~ 70%，低于U原料路径所得的~ 97%浓度，醋酸盐是其主要的伴生产物，因而进一步纯化Ψ5P产品的工艺路线十分重要。反应所获得的Ψ5P可以直接磷酸化为ΨTP，也可以在反应混合物中直接脱磷酸化为Ψ，纯度超过97%。

表2. 两种级联反应过程合成Ψ5P的指标对比

鉴于激酶对底物磷酸化具有足够的位点和立体控制，反应设计和工程的挑战在于高效再生核苷5'-三磷酸（NTP）磷酸供体。此前已报道的激酶反应面临反应控制因素复杂、成本高、难以扩大化、产物选择性低分离困难等问题，因此使用利用AcP的AcK反应具有独特优势，对磷酸化反应具有优异的产率。AcP原料的合成需求、pH控制需求和对水解的敏感性是其主要缺点。对于Ψ5P合成，基于反应工程的节约性原则，更倾向于直接从AcP进行AcK反应。相关计算显示，当前研究中所展示的Rib磷酸化过程的产量（950 mmol/L/h）已经接近了物理OTR（氧气转移速率）的上限。总体来说，该研究通过优化Rib磷酸化过程实现了以AcP为磷酸供体的反应类型中创纪录的产物浓度和产量。性能结果表明，依赖于NTP的磷酸化反应能与工业生物催化的技术经济目标相匹配。

结论

本工作成功展示了一种用于合成C-核苷类似物的一锅法磷酸化-缩合级联反应策略，该策略具有高效性、灵活性等显著特征。在研究工作中，通过优化ATP的循环利用促进激酶催化的磷酸化反应，以及优化固体尿嘧啶底物的添加方式从而促进缩合反应，显著提高了磷酸化和缩合步骤的反应效率。总的来说，这种策略不仅为合成Ψ5P提供了一种有效的途径，而且因其具有合成C-核苷产品的能力而在生物学应用以及RNA结构与功能研究中存在潜在的应用价值。此外，本工作涉及到的生物催化与反应工程的结合与反应参数优化策略，有望在工业生物催化中发挥重要作用。

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Phosphorylation-condensation cascade for biocatalytic synthesis of C-nucleosides

Andrej Ribar, Martin Pfeiffer, Bernd Nidetzky

Chem Catal., 2024, DOI: 10.1016/j.checat.2024.101127

（本稿件由Cell Press供稿）