Nano Lett.：模块化组装的局域HCR用于原位mRNA成像

对细胞和活体动物中的生物分子进行原位成像，监测其在生理过程中的表达波动，对于破译其功能和疾病发生机制具有重要意义。信使RNA（mRNA）是一种指导蛋白质合成的遗传RNA分子，其异常表达已被证明与癌症的进展和预后有关。因此，肿瘤相关mRNA的扩增成像对于癌症的诊断和预后至关重要。然而，这些靶点在细胞和机体中的浓度极低且动态波动，这需要具有足够灵敏度的探针。

无酶参与的等温核酸扩增技术是实现低丰度目标灵敏检测的有力方法之一。其中，杂交链反应（HCR）是近十多年来常用的一种等温核酸扩增方法。然而，基于HCR的体系仍然面临着反应动力学慢、反应不充分的问题。尽管局域化HCR策略的发展是克服上述问题的一种前瞻性方法。但是，目前大多数设计缺乏模块化能力，发夹DNA分子的负载容量低导致反应程度和反应速率受限，阻碍了其在活体原位检测和临床应用中的推广。

近日，湖南大学的黄晋教授和中南大学的谢努力助理教授提出了模块化组装的局域HCR反应体系。通过引入模块化组装概念来构建具有简易DNA骨架模板的局域HCR反应，首先两种发夹DNA分子被对称有序地组装在H型DNA模板（HM）两侧。其次，由于HMS的结构简易且可拓展，两种HM模块可以通过粘性末端的设计实现进一步交替组装，最终形成具有高发卡DNA负载容量的结构（HHS）。当目标RNA缺失时，HHS中的发夹DNA不发生反应。只有当识别目标RNA分子后，HHS内会发生快速的局域化HCR反应。HHS分子结构内的反应完成后，还可以发生多个HHS结构间反应，生成超支化纳米结构（图1）。该方法具有三个优点：(i) 模块化结构设计，具有较高的负载容量；(ii) 快速响应和高信噪比增益；(iii) 具备细胞和动物体内原位传感的通用化能力。

图1. 本工作的设计原理示意图。

作者选取乳腺癌细胞作为研究模型，Tk1 mRNA作为研究对象，对HHS探针进行了验证。相较于缺失H2发卡的HM组和HM组相比，HHS无论是在溶液中和细胞水平都表现出了更快的反应速度。从4小时的荧光成像结果显示，HHS的亮度最强，而HM只能达到40%左右。此外，还研究了探针区分肿瘤细胞和正常细胞的能力，以及药物刺激作用下检测细胞内mRNA表达水平波动的能力。

图2. HHS在细胞水平的mRNA检测。

在动物模型中，采用MCF-7荷瘤小鼠模型，研究了其在体内原位放大成像的能力。使用三种cy5标记的探针（HHS、HM和不含H2的HM），均为瘤内原位注射。HHS的荧光信号在30 min内迅速升高，在2 h内逐渐达到饱和。HM则由于稍低的局域化程度其荧光信号弱于HHS。不加H2组的HM几乎没有荧光变化。三组荧光图像的定量分析显示，HHS的信号强度比HM组高2倍，比不含H2的HM组高5倍，再次证明HHS的局域HCR反应动力学更快、灵敏度更高。

图3. HHS在动物水平的mRNA原位检测。

相关成果近期发表在Nano Letters 上，文章的通讯作者为湖南大学黄晋教授和中南大学谢努力助理教授，第一作者为湖南大学的博士研究生刘世源和南华大学王姣丽博士。该研究工作得到国家自然科学基金和湖南省自然科学基金的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Modular assembled localized hybridization chain reaction for in situ mRNA amplified imaging

Shiyuan Liu, Jiaoli Wang, Yu Chen, Jiahao Fan, Bin Du, Ruiting Liu, Xiaobei Zhu, Kemin Wang, Nuli Xie*, Jin Huang*

Nano Lett., 2024, 24, 11590-11598, DOI: 10.1021/acs.nanolett.4c03099

研究团队简介

黄晋，湖南大学化学化工学院教授，博士生导师，教育部青年长江学者，湖南省杰出青年基金获得者，湖南大学岳麓学者。研究兴趣是DNA纳米材料及生物医学应用。先后主持和参与国家及省部级科研项目近20项，已在国际学术期刊上发表论文200余篇，总引用次数超过9000次（H因子51），获发明专利8项。

https://www.x-mol.com/university/faculty/66377 

谢努力，中南大学湘雅药学院助理教授，硕士生导师。研究兴趣为DNA纳米技术在分子计算、生物传感、疾病诊疗领域的应用。目前主持国家自然科学基金青年项目、湖南省自然科学基金青年项目、化学生物传感与计量学国家重点实验室开放课题基金、中南大学人才启动经费等多个项目。已在Nature(二作)、JACS、ACS Nano、Chem. Sci.、Anal. Chem.、Chem. Commun.等国际知名期刊发表一作论文十余篇，总引次数达 1800次以上。