Agw 吲哚-N-过氧化修饰对结核分枝菌关键金属蛋白酶KatG功能的调控

注：文末有研究团队简介及本文作者科研思路分析

人体的免疫系统可以利用过氧化氢对抗入侵的病原体。在漫长的生物演化进程中，大多数病原体已经进化出能够分解过氧化氢的酶，以抵抗宿主的这种免疫反应。结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（M. tuberculosis，Mtb）感染引起的一类重大慢性传染病。据世界卫生组织报道，2022年全球估算结核发病人数为1060 万。中国仍然是结核病例第三多的国家，2022年新发患者数为74.8万。Mtb依靠一种含血红素的双功能酶——过氧化氢酶-过氧化物酶（catalase-peroxidase, 简称KatG）来分解过氧化氢。KatG含有一类独有的蛋白质交联辅因子，即蛋氨酸-酪氨酸-色氨酸（简称MYW）辅因子（图1A），这种翻译后产生修饰的蛋白质辅因子对于KatG的过氧化氢酶 (catalase) 活性至关重要，因而是结核分枝杆菌对抗人体免疫系统的关键。过氧化物酶 (peroxidase) 是KatG的另外一种主要功能，帮助病原体细胞活化利用环化物。迄今为止最成功的一线抗结核分枝杆菌药物异烟肼（isoniazid）的作用机制就是利用KatG的过氧化物酶功能将其转化为其活性形式，进而抑制结核杆菌的细胞壁生成。KatG基因突变是常见的导致异烟肼耐药的原因之一。简而言之，过氧化氢酶活性用于中和宿主的免疫攻击；过氧化物酶则帮助激活抗生素以抑制病菌（图1B）。

图1. 双功能过氧化氢酶-过氧化物酶 (KatG) 的晶体结构和催化功能

值得一提的是，一种过氧化修饰的MYW辅因子结构，MYW-OOH（含有吲哚-N-连接过氧化修饰基团N-OOH），曾经在KatG的晶体结构中被观测到。迄今为止，N-连接的过氧化修饰仅在KatG和一种黄素依赖的单加氧酶的晶体结构（6SGG）中被观测到。关于MYW-OOH的科学问题包括：1）目前，尚未有含有吲哚-N-连接过氧化小分子的相关报道，为何MYW-OOH能够在KatG酶活中心稳定存在？2）这种翻译后修饰是否可逆？其形成和去除的生化条件是什么？3）这些生化条件的生物学意义如何？对未来抵抗MtB有何启示？然而，由于MYW-OOH的化学稳定性不佳，在溶液状态下始终未能实现对MYW-OOH的表征。这种特殊的MYW-OOH结构的潜在生化活性和生理功能仍未被充分揭示。因此，需要进一步研究其在溶液状态下的特性，以及它对KatG酶功能的潜在影响，尤其是在Mtb应对过氧化氢时的作用。这些研究可能会揭示该修饰在病原体对抗宿主免疫反应中的后果，并且有助于深入理解其在抗结核分枝杆菌治疗中的潜在应用。

图2. 两种天然存在交联辅因子图示——MYW-OOH 临时锁定过氧化氢酶活性，呈现出独特的自动解锁机制。过氧化物或高温会将MYW-OOH转化为MYW，从而恢复KatG在人体内的过氧化氢解毒能力。

近日，德克萨斯大学圣安东尼奥分校（UTSA）刘爱民教授（点击查看介绍）团队找到了KatG的MYW-OOH在溶液状态下的存在条件，并从生化角度阐明了其在结核分枝杆菌KatG的作用（图2）。这些结果近日发表在《德国应用化学》（Angewandte Chemie Internal Edition）。第一作者是李家松助理教授，共同作者是段然和其他博士研究生。

图3. 温度效应导致结核分枝杆菌KatG具有两种不同形式的蛋白质来源交联辅因子。室温下主要是MYW-OOH；体温下是MYW。

在室温下表达KatG（以下简称KatG_25）的过程中，该研究团队首次检测到溶液中MYW-OOH是结核分枝杆菌KatG蛋白质辅因子的主要存在形式，并利用多种谱学手段在溶液和晶体结构中对其加以表征（图3, A-E）。这个发现也令研究 MYW-OOH 的化学稳定性和生化功能成为可能。在此基础上，作者首次发现了 MYW-OOH 能够暂时抑制其过氧化氢酶活性，并呈现出催化反应“滞后期”现象（图3, F-G），表明MYW-OOH使KatG处于一种临时的锁定状态。研究进一步表明，辅因子转化的条件是暴露于过氧化氢或升高温度，这可以有效去除蛋白质辅因子中的过氧化修饰，将MYW-OOH恢复为MYW，从而恢复KatG对过氧化氢的解毒能力（具体信息参见论文原文）。

晶体结构显示，MYW-OOH可以被血红素铁、组氨酸108和一个水分子所稳定，这也为用化学方法制备更多的氮(N)-连接的过氧化物 (N-OOH) 提供了样板。晶体内化学反应直观展示了这个特殊化学环境被破坏后MYW-OOH转化为MYW（图4）。这些研究结果证明氮(N)-连接的过氧化修饰是有生物学意义的辅因子修饰。含有MYW的KatG处于可以执行catalase功能的状态；而含有 MYW-OOH 的 KatG 表现出一种处于休眠但随时待命的状态。这一发现揭示了MYW-OOH在调控KatG酶功能中的关键作用，以及其在应对氧化应激条件下的动态调节机制。

图4: 在热处理或过氧化物处理下，KatG的辅因子从MYW-OOH转化为MYW。

同时，作者针对结核分枝杆菌双功能酶KatG的催化机制提出了新的见解，特别强调吲哚-N-过氧化修饰辅因子在体内体外调节其过氧化氢酶功能中的关键作用。这种进一步化学修饰翻译后产生的蛋白质交联辅因子的独特调节机制体现了病原体在环境变化时具有的自适应能力。同时，围绕MYW辅因子的化学修饰的深入研究，可能为抗结核分枝杆菌新策略提供重要的启示与灵感。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Indole-N-Linked Hydroperoxyl Adduct of Protein-Derived Cofactor Modulating Catalase-Peroxidase Functions

Jiasong Li, Ran Duan, Ephrahime S. Traore, Romie C. Nguyen, Ian Davis, Wendell P. Griffth, Douglas C. Goodwin, Andrzej A. Jarzecki, Aimin Liu

Angew. Chem. Int. Ed., 2024, DOI: 10.1002/anie.202407018

研究团队简介

刘爱民 教授，美国德州大学圣安东尼奥分校化学系教授，Lutcher Brown讲席教授，美国AAAS科学协会会员。

课题组长期致力于研究多种氨基酸在重要生命过程中的作用，采用代谢酶学、化学生物学、生物无机化学和生物物理学等方法。研究方向包括氨基酸的代谢、交联、氧化，金属酶的催化机理，C-H/C-F键的活化，蛋白辅酶的生物合成，自由基酶学，酶介导的信号传导以及基因调控等，涉及抗生素天然产物、抗衰老、癌症和免疫等领域。研究成果发表在PNAS、JACS、Nature Chem Biol、Nature Commun.、Angew. Chem.、Chem. Sci.、JBC、ACS Catalysis和Biochemistry等期刊上，总计100余篇。详见课题组网站：https://Feradical.utsa.edu/ 

https://www.x-mol.com/university/faculty/5229 

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：重新思考病原体研究：传统研究病原体的方法通常只在人体体温下进行，忽视了它们在体外生命周期的关键阶段。我们认为，研究机会性病原体在不同环境条件（包括较低温度）下的表现，可以更全面地理解它们的传播动态和潜在爆发风险。基于这一理念，我们突破了传统只关注37°C体温的研究范式，探讨了结核分枝杆菌（Mtb）在体外环境压力下的应对机制。尽管与体内相比，病原体在体外的生存时间相对较短，但这一阶段对其寻找新宿主至关重要。采用这一更广阔的视角，有助于制定更有效的策略来控制其传播。通过这一研究，我们发现KatG在室温条件下稳定存在一种独特的化学修饰MYW辅因子，即MYW-OOH。

探究MYW-OOH在溶液状态下是否存在及其生化功能：之前提出的假说是MYW-OOH是反应中间体。但是，反应中间体一般情况下不应该在室温下以稳定状态存在， 否则就不是反应中间体。所以我们设想，MYW-OOH可能是一种特殊的翻译后修饰。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：1）MYW-OOH的不稳定性。如何表达纯化到主要含MYW-OOH的天然KatG蛋白是深入表征这种翻译后修饰的关键。2) 理解氮-连接的-OOH 在MYW-OOH中的生化功能是解决这个问题的关键。3）如何将谱学分析和晶体结构融会贯通。扎实的理论基础和敏锐的数据分析是解读扑朔迷离实验数据的关键。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：这对未来开发针对Mtb的药物提供了启示：如果可以通过靶向MYW修饰，改变其在酶活中心的稳定存在，这样可以破坏病原体KatG的抗氧化防御机制，促进其过氧化物酶活性，和异烟肼药物同时使用的时候进而提高因为katg结核杆菌分支基因突变引起的多药耐药性治疗效果。