细菌发光的电场调控

生物发光是广泛存在于细菌、真菌、昆虫以及海洋生物等的一种发光现象。由于其操作简单、检测时间短、灵敏度高，生物发光已广泛应用于生物分析、生物成像、环境毒物检测等许多领域。然而，由于生物组织的散射和吸收削弱了光子能量，其应用受到限制。为了进一步提高其光谱性质和扩展其应用，迫切需要深入了解其光谱调谐机制。本文采用TD-DFT以及QM/MM计算等方法深入探索了细菌荧光素酶蛋白环境对荧光光谱的调节作用，以及通过改变静电环境来调节发光波长的可能性。

图1. (A) QM(TD-CAM-B3LYP/6-31+G**)/MM优化的蛋白质环境下发光体的几何结构。(B) TD-CAM-B3LYP/6-31+G**优化的真空条件下发光体的几何形状。

在研究长程静电相互作用对发光的调节作用之前，文章先研究了蛋白环境对发光体(¹HFOH*) 几何形状的影响。通过与气象下优化的结构对比发现：在蛋白质环境中，发光体的异咯嗪环呈现更加平面的构象（参见图1）。与之前的结果一致，TD-DFT以及TD-DFT/MM的计算结果表明，发光体的几何构型对荧光的发射起决定性作用。扭曲的构象是不发光的，只有平面的构象才能保证发光的效率。蛋白质环境通过位阻效应和氢键相互作用将异咯嗪环限制在平面构型，阻断了由圆锥交叉介导的由S₁态回到S₀态的内转换过程，从而提高了荧光的量子产率。

图2. 气相中获得的¹LFOH*的荧光光谱性质。

基于在蛋白环境下优化得到的可发光的平面构象，文章通过气象下的TD-DFT单点计算分析了发光体与荧光发射相关的性质。气象下，荧光发射波长为412 nm，振子强度为0.106。荧光发射涉及的轨道主要是最高占据分子轨道（HOMO）和最低非占据分子轨道（LUMO）。HOMO离域在异咯嗪环上，而LUMO主要集中在右侧的嘧啶环上（图2A）。因此，在S₀到S₁的跃迁过程中，右侧嘧啶环变得富电子，而发光体左侧变得缺电子，这一点通过空穴和电子图（图2B）得到了进一步的验证。S₀态的偶极矩（μ₀）为6.20 D，大致指向负X方向；S₁态的偶极矩（μ₁）也指向负X方向，但其幅值较大，为14.33 D（图2C）。较大的差偶极矩（Δμ = μ₁ − μ₀ = 8.30 D）表明S₁态具有显著的电荷转移（CT）特性（参见图2B）。

图3. 溶剂极性对¹LFOH*荧光光谱性质的影响。

进一步，文章对静电效应对光谱的调节作用进行了深入的研究。TD-DFT的计算结果表明：随着溶剂极性的增加，发射波长的最大值 λ_F 发生红移（图3A）；振子强度随溶剂极性的增加而增加（图3B）。不同溶剂下S₀和S₁态的能量(分别为E₀和E₁)计算表明:（1）极性溶剂同时稳定了S₀和S₁态;（2）溶剂极性（ε）越大，稳定效果越强;（3）S₁态的稳定化效果略强于S₀态（图3C）。因此，发射光谱的红移是由溶剂极性对S₁态更强的稳定效果导致的。因为静电相互作用与偶极矩的大小直接相关，偶极矩越大，稳定性越强，文章进一步分析了不同溶剂下S₀和S₁态的偶极矩（μ₀和μ₁，参见图3D）。μ₁和μ₀随溶剂极性的增大而增大，且μ₁始终大于μ₀。偶极矩的变化很好地解释了图3C中能量的变化，从而从根本上解释了图3A所示的荧光发射波长随溶剂极性的变化。

图4. 笛卡尔坐标系的定义说明。

由于蛋白空腔中荧光团周围的电场并不是均匀的，它与极性溶剂中的电场存在显著差异，文章进一步研究了定向的外加电场（OEEF）对光谱的调节作用。电场的施加方向参考图4。TD-DFT的计算结果发射波长对施加在X方向的电场最为敏感。施加X方向的正向电场（+F_X）会导致荧光波长的蓝移，而负X方向的电场会导致红移(图5A)。一个中等强度的电场（0.0075 au, 38.6 MV/cm），施加在X负方向，会引起发射波长100 nm的红移。有意思的是，振子强度对F_X并不敏感(图5B)。S₀和S₁态的能量（E₀和E₁）分析表明：正X方向的电场会增大E₀和E₁；而负X方向的电场会导致E₀和E₁的减小（图5C）。尽管变化趋势相同，但他们对电场的响应强度是不同的，S₁态比S₀态对电场更敏感，相同场强下E₁的变化大于E₀的变化。图5C直观地解释了图5A所示的发射波长在电场作用下的变化。有趣的是，垂直发射能量(E_F = E₁−E₀)与电场强度F_X呈线性相关关系，E_F和F_X可以用一个简单的线性方程来拟合:E_F = 81.59 F_X + 3.00。E_F对电场的线性依赖关系表明通过控制电场可以对发光波长进行精确的控制。与溶剂中的情况类似，文章进一步分析了不同F_X下的S₀态和S₁态的偶极矩（图5D）。偶极矩的变化趋势很好的解释了图5C所示的能量变化情况。值得注意的是，图5C中拟合直线的斜率(81.59 eV/au = 7.62 D)与不添加电场时差偶极矩X分量的负值(7.80 D，参见图2C)近似相等。这表明在研究所施加的电场强度范围内，电场的效应遵循一阶Stark效应。文章对振子强度变化的分析表明：极性溶剂中振子强度的增强主要来自于跃迁偶极矩的增大，而F_X下振子强度的轻微变化源于垂直发射能量变化与跃迁偶极矩变化之间的相互抵消。

图5. F_X对¹LFOH *荧光光谱性质的影响

蛋白环境下发光波长（约490 nm）与真空环境下发光波长（约410 nm）的对比表明，发光波长的红移来自于蛋白空腔中的沿X轴负方向的内电场。最后，作者分析了影响荧光发射波长的关键带电残基，如图6A所示。发光体左侧带负电荷的残基，如Glu175、Glu200和Asp314，以及右侧带正电荷的残基，如His45、Arg107、Lys112、Lys286和B链的Arg85，产生X轴负方向的电场，会导致光谱的红移。如果把这些残基的点电荷湮灭会使光谱发生蓝移（图6B）。相反，左侧带正电荷的残基（Lys201和Arg290）以及右侧带负电荷的残基（Glu43、Asp111、Asp113以及B链的Glu88）产生X轴正方向的电场，他们的存在会导致光谱的蓝移。如果把这些残基的点电荷湮灭会使光谱发生红移（图6B）。

图6. (A) 荧光团附近的关键带电残基。(B) 关键残基的点电荷湮灭引起的λ_F的位移。

相关成果近期发表在理论与计算化学权威期刊J. Chem. Theory Comput.上，文章的通讯作者是北京师范大学珠海校区文理学院、先进材料研究中心王展峰，第一作者是北京师范大学珠海校区文理学院化学系硕士研究生付晓迪。该研究工作得到了国家自然科学基金（22203007，22373010和21973005）以及北京师范大学科研启动基金(310432104)的支持。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Theoretical Insight into the Fluorescence Spectral Tuning Mechanism: A Case Study of Flavin-Dependent Bacterial Luciferase

Xiaodi Fu, Wenwen Diao, Yanling Luo, Yajun Liu, and Zhanfeng Wang*

J. Chem. Theory Comput., 2024, DOI: 10.1021/acs.jctc.4c00950

王展峰博士简介

王展峰，北京师范大学珠海校区文理学院化学系、先进材料研究中心副研究员。2017年于中国科学院物理研究所取得博士学位，2017.7-2019.4在以色列希伯来大学Sason Shaik教授课题组从事博士后研究，2019.7-2022.3在厦门大学王斌举教授课题组继续博士后研究，2022年3月加入北京师范大学珠海校区任特聘副研究员，2023年7月晋升为副研究员。王展峰博士主要应用分子动力学（MD）模拟、量化（QM）计算、QM/MM以及QM/MM MD等计算手段研究酶的催化机理。目前已在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., ACS Catal., J. Chem. Theory Comput.等期刊发表论文十余篇。计划每年招收博士研究生1名、硕士研究生1名，欢迎感兴趣的同学联系（zfwang@bnu.edu.cn）并加入本课题组。

http://english.camrbnu.com/userDetail?personId=16 

https://fas.bnu.edu.cn/jyjg/xsgk/hxx1/xsszhx/hxfx2/ef55c450c9e443f3a2daa792055739cd.htm 

https://www.x-mol.com/university/faculty/360135