浙江大学吴起课题组Angew：光激发脂肪酸光脱羧酶催化合成手性α-四氢萘酮

在过去的十年中，可见光催化的自由基反应一直是有机合成化学的研究热点。在传统的光催化反应中，如何操纵高活性的自由基中间体进行立体选择性合成是一个长期存在的挑战。幸运的是，近年来发展的非天然光酶催化体系为光激发的自由基中间体的立体选择性调控提供了新的思路。最近Hyster、Zhao和黄小强等人报道了一系列含黄素/烟酰胺辅因子依赖酶的非天然光催化新反应，包括光诱导不对称自由基脱卤、环化和分子间氢烷基化/芳基化/胺化/磺化等。这些例子极大地扩展了非天然光酶的应用。然而，天然存在的光酶反应非常罕见，如何从已知的酶中发现新的光反应性一直是当下绿色合成领域的重点课题。

来源于小球藻的脂肪酸光脱羧酶（CvFAP）作为一种罕见的天然光酶，引起了学者的广泛关注。CvFAP催化的天然反应是长链脂肪酸的自由基脱羧生成长链烷烃。作者在过去几年中，一直聚焦于CvFAP的蛋白质工程改造，并拓展其在手性合成反应中的应用，相继报道了CvFAP催化外消旋羧酸的动力学拆分（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 8474），油酸和反油酸的顺反双键选择性脱羧反应（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 20695），脂肪醇草酸酯的脱羧动力学拆分（Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202318374）以及羧酸的脱羧氘代反应（Nat. Commun. 2021, 12, 3983）等，但是针对CvFAP催化非天然新反应的研究却鲜有报道。

在以前报道的酮还原酶（KREDs）或烯还原酶（EREDs）所催化光酶非天然反应中，黄素辅因子负责两次单电子还原：还原态黄素氢醌（FMN_hq）首先作为单电子还原剂催化形成自由基中间体，而黄素半醌态（FMN_sq）作为氢原子源终止自由基物种，自身变为氧化态黄素，并利用NADPH还原回FMN_hq，从而完成催化循环（图1a）。与这种烯还原酶催化模式不同，作者以前曾报道了光诱导环己酮单加氧酶(CHMO)催化 α，α-卤代氟酮的催化立体选择性脱卤反应，它也涉及FAD_hq/FAD_sq氧化还原对，但是对自由基的终止却是采用ET/PT过程（图1a）（见Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202211199）。

与黄素/烟酰胺共依赖的EREDs和CHMOs两种酶不同，CvFAP是一种活性位点只含有黄素的天然光酶。受CvFAP天然氧化脱羧过程的启发（图1b），浙江大学吴起（点击查看介绍）课题组设想CvFAP是否可以通过涉及FAD_ox/FAD_sq氧化还原对的不同机制催化光酶新功能反应（图1c），从而扩展CvFAP除脱羧外的其他立体选择性新转化。

图1. CvFAP的光激发脱卤还原反应新功能

作者首先对设想的天然光能酶CvFAP催化的脱卤还原反应进行了初步试验和优化。结果发现，在450 nm光照下，以含有三乙醇胺（TEOA）作为电子牺牲供体的缓冲溶液中，模型底物α,α-氟氯取代-3,4-二氢-1(2H)-萘酮在野生型CvFAP催化下可以以99%产率和99：1的立体选择性得到S构型α-氟代-3,4-二氢-1(2H)-萘酮。为了获得具有更好催化活性和选择性的CvFAP突变株，作者对该酶进行了蛋白质工程改造。利用前期发展的聚焦理性迭代定点突变策略（FRISM）（J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 7934），作者获得了具有更高活性的Y466A突变株。值得指出的是，作为一个天然的光酶，CvFAP（Y466A突变株）的TTN是以前报道的CHMO的4.5倍，这可能是因为前者具有更高的光吸收量子效率。

接下来，作者测试了CvFAP催化还原脱卤反应的底物谱范围（图2、图3）。结果表明，Y466A突变体对于一系列具有不同苯基取代、不同环大小的α,α-氯氟酮底物都可以以很高的产率和立体选择性获得相应的手性α-氟代四氢萘酮。而一系列具有不同结构的α-氯代-α-烷基四氢萘酮也可以经由脱氯还原反应以高产率和高ee值得到手性α-烷基四氢萘酮。CvFAP同样也可以催化一系列α-乙酰氧基-α-烷基四氢萘酮的脱乙酰氧基还原反应，从而实现手性α-烷基四氢萘酮的合成。这些结果表明CvFAP具有较宽广的底物谱，从而展示了重要的合成潜力。

图2. CvFAP的Y466A突变体催化立体选择性脱卤还原反应的底物谱

图3. CvFAP的Y466A突变体催化立体选择性脱乙酰氧基还原反应的底物谱

为了阐明这一新过程的机理，作者进行了一系列的机理实验研究（图4）。首先，在TEMPO存在的情况下不形成产物，这表明反应经历了自由基过程（图4a）。为了初步确定CvFAP内FAD辅因子的哪个活性物种负责自由基引发过程，作者进行了一系列光谱实验（图4b）。最初的氧化态黄素（FAD_ox）在~467 nm和390 nm处有两个强吸收带。在蓝色照射后，FAD_ox完全转化为阴离子半醌态黄素（FAD_sq）。而当光还原的CvFAP蛋白受到底物作用时，光谱表明存在从FAD_sq到FAD_ox的再转化。加入底物后的发射光谱也显示出类似的转变。这些数据表明，FAD_sq负责电子转移到底物，导致随后Cl¯的离去，从而生成了α-羰基自由基。

α-羰基自由基的下一个淬灭步骤可能涉及两种过程：立体选择的氢原子转移(HAT)或电子转移/质子转移(ET/PT)。氘代实验结果表明产物的手性氢可能是通过ET/PT过程从溶剂中产生的，而不是通过HAT过程从黄素中获得。此外，活性位点周围一些可能提供质子源的重要氨基酸的突变结果也排除了氨基酸作为质子源的可能性。这些结果清楚地表明缓冲液可能是质子供体。此外，HAT和ET/PT两种催化途径的DFT计算和能量分布也支持相应的结论。最后，作者还通过分子动力学模拟等计算化学手段探究了天然光能酶CvFAP催化的非天然还原脱卤反应的高立体选择性的结构基础。

基于上述结果，作者提出了一个可能的催化机理（图4d）。在牺牲电子供体TEOA的存在下，酶结合的FAD_ox被光还原成阴离子半醌 (FAD_sq)。该物种可以还原1a生成α-羰基自由基和FAD_ox。然后连续光还原FAD_ox以再生FAD_sq。自由基的终止是通过再生的FAD_sq引发的第二次SET和随后的与水的质子化来完成。区别于以往报道，结果表明CvFAP以FAD_ox/FAD_sq氧化还原对催化反应进程，并通过ET/PT过程淬灭了自由基中间体，这一全新的分子机制尚未在该类酶家族与其他光酶催化研究中发现。

图4. 一系列机理实验和提出的可能反应机理

综上所述，吴起课题组受CvFAP天然脱羧反应过程的启发，报道了CvFAP催化的非天然还原脱卤/脱乙酰氧基反应，以优异的催化活性（高达99%）和立体选择性（高达99：1 e.r.）合成了一系列手性α取代四氢萘酮衍生物。机理研究表明，CvFAP以FAD_ox/FAD_sq氧化还原对催化反应进程，并通过ET/PT过程淬灭了自由基中间体，这一全新的分子机制尚未在该类酶家族与其他光酶催化研究中发现。该研究挖掘了CvFAP的催化潜能，极大地拓展了CvFAP在绿色有机合成中的应用。

该工作得到国家重点研发计划“绿色生物制造”项目2021YFC2102000，国家自然科学基金22277105、22307111和浙江省自然科学基金重点项目LZ24B020003的支持。

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Catalytic Promiscuity of Fatty Acid Photodecarboxylase Enables Stereoselective Synthesis of Chiral α-Tetralones

Weihua Xu*⁺, Kaihao Mou⁺, Zhenyu Lu⁺, Xiuwen Kang, Yue Guo, Bei Ding, Zhirong Chen, Zhiguo Wang*, and Qi Wu*

Angew. Chem. Int. Ed., 2024, DOI: 10.1002/anie.202412862

导师介绍

吴起，浙江大学化学系教授、博士生导师，入选浙江省高层次人才特殊支持计划；Bioresources and Bioprocessing、Green Synth. Catal. 的青年编委。近年来，围绕天然酶催化剂存在立体选择性单一、无法有效调控，现有酶催化反应类型有限等关键科学问题，集中从事“酶的理性设计与选择性精准调控”研究，在酶定向进化新方法发展、多种重要工业用酶的选择性精准调控和活性提升改造、酶催化的多功能性新反应发现、酶催化剂在多层次手性精准合成中的应用等方面取得了创新性的研究成果。近5年来以第一和通讯作者共发表SCI论文30余篇，包括Angew. Chem. Int. Ed. (7篇)，J. Am. Chem. Soc. (2篇)、Nat. Comm. (2篇)等。作为副主编出版中文教材2本，参与编写英文专著3本。主持了国家重点研发计划绿色生物制造课题1项，国家基金委“多层次手性物质的精准构筑”重大研究计划培育项目、面上项目、青年项目等6项国家基金，以及浙江省自然科学基金重点项目、浙江省科技厅绿色化工重大科技专项等。

吴起—浙江大学个人主页：

https://person.zju.edu.cn/0003155 

https://www.x-mol.com/university/faculty/14407