吡唑啉酮-蛋白质相互作用的发现及其在细胞膜长滞留染色和功能化修饰中的应用

近日，深圳大学彭孝军院士、陈小强教授团队在Journal of the American Chemical Society 发表研究论文，发现吡唑啉酮可通过与碱性氨基酸如精氨酸的多重非共价相互作用实现对蛋白质的快速、稳定结合，这一结合能力赋予含吡唑啉酮的系列染料优异的细胞膜长滞留成像性能，并可通过对膜外蛋白的结合实现简便快捷的细胞膜功能化。

图1. 常见的细胞膜修饰策略和本文报导的膜蛋白非共价结合策略。

细胞膜是细胞的基本结构和物质交换窗口。对细胞膜的追踪和功能化修饰在细胞生命学研究和疾病的诊断、治疗中具有重要价值。例如，对细胞膜进行修饰以赋予靶向、药物、荧光等新功能在细胞疗法、细胞膜仿生纳米材料等领域备受关注。然而，目前的细胞膜修饰策略要么操作复杂、要么在结合稳定性或安全性上有所顾虑，难以满足此类技术的进一步发展需求。为此，深圳大学彭孝军研究团队发现并探索了一类新型细胞膜修饰策略，可以通过吡唑啉酮分子平台实现对细胞膜的快速、安全且稳定的结合，满足活细胞的长期细胞膜追踪需求和人工赋予识别基团的功能化需求。

在文中，作者首先通过系列尼罗蓝结构探究了依赖吡唑啉酮实现细胞膜成像的核心作用位点，发现该效果由吡唑啉酮的α-C亲核位点所主导，无吡唑啉酮基团或活性位点封闭后细胞膜结合效果失效。并且，吡唑啉酮的细胞膜导向功能可以推广到不同的染料母体，如萘酰亚胺、bodipy和罗丹明。

图2. 系列吡唑啉酮染料和对比分子的成像结果。 

通过对细胞组分的提取，研究团队判断含吡唑啉酮染料主要分布于细胞膜蛋白组分。为进一步验证吡唑啉酮与蛋白质的结合，作者提取了细胞膜蛋白，通过凝胶电泳分析发现含吡唑啉酮染料可分布于整个膜蛋白带，这暗示着对蛋白质的非特异结合能力。进一步与BSA、α-酸性糖蛋白、酯酶和抗体IgG的凝胶结果也支持了这一结论。实验通过对比分子的染色结果排除了染料自身吸附作用的可能性。有趣的是，将吡唑啉酮生物素化修饰后，该分子可以经由亲和素磁珠对蛋白质BSA进行捕获。

图3. 吡唑啉酮-细胞膜结合的验证。 

为了进一步研究吡唑啉酮与蛋白质结合的作用机制，研究团队通过晶体培养、等温滴定微量热（ITC）、高效液相分析色谱的多种手段，分析了吡唑啉酮和20种天然氨基酸的相互作用。结果显示，吡唑啉酮可与含酰胺氨基酸和碱性氨基酸进行非共价结合。其中，经ITC检测发现吡唑啉酮与精氨酸结合能力最为显著，其结合比例为1:1，或是通过盐桥和氢键的多重弱相互作用实现两者的稳定结合。

图4. 蛋白质结合的机理探究。

基于以上结合机制，作者细致探索了此类细胞膜染料的成像性质。与商业化细胞膜染料DiO相比，吡唑啉酮修饰的NBS-N-P可以在24 h观察期间保持清晰的细胞膜成像，且无明显细胞内化荧光。非共价结合模式赋予了该类染料快速的成像速度；细胞膜成像在多种肿瘤和非肿瘤细胞有效。通过MTT实验和活死细胞成像实验，确认了这一成像方式具有良好的生物安全性，并且发现染色后细胞传代至第4代依然具有细胞活性和红色膜荧光。

图5. 细胞膜长滞留成像和安全性评估。

此外，为进一步拓展其细胞膜功能化修饰的应用。研究团队对这类吡唑啉酮染料用于多细胞的细胞标记、细胞膜的体内长期标记和赋予细胞膜识别基团进行了探究。值得一提的是，在长达21天观察期后，NBS-N-P依然停留在标记的肿瘤细胞的细胞膜上。通过这一稳定结合能力，作者以生物素化的吡唑啉酮为介质赋予了细胞膜生物素修饰，其后细胞可被亲和素修饰的磁珠识别并捕获。

图6. 细胞追踪和生物识别。

综上，彭孝军研究团队报导的吡唑啉酮类结构不仅展现了与蛋白质结合的新型作用机制，也为细胞膜的功能化修饰提供了一种简捷、稳定的强有力手段，有望进一步推动细胞膜相关的诊断和治疗技术的发展。

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，第一作者为深圳大学熊涛博士，深圳大学彭孝军院士和陈小强教授为共同通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Pyrazolone-Protein Interaction Enables Long-Term Retention Staining and Facile Artificial Biorecognition on Cell Membranes

Tao Xiong, Yingchao Chen, Qiang Peng, Mingle Li, Sheng Lu, Xiaoqiang Chen*, Jiangli Fan, Lei Wang, Xiaojun Peng*

J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c08987

通讯作者介绍

彭孝军院士

中国科学院院士，深圳大学特聘教授，博士生导师。长期从事精细化工领域研究：从基础理论研究出发，形成了近红外比率荧光菁染料探针分子平台，为解决复杂体系荧光信息的定量获取提供了新方法，被国内外广泛应用；构建的耐候性喷墨打印染料产品体系，大规模产业化，为我国成为彩色喷墨打印耗材大国，做出了重要贡献；创制的荧光探针在血液细胞分析系统的产业化应用，促进了我国在血液临床分析装备领域从空白到国际一流的跨越。发表论文350余篇，授权国内外发明专利50余项，参与起草国家标准20余项、ISO国际标准5项。作为第一完成人，获2013年国家自然科学二等奖和2006年国家技术发明二等奖，以及4项省部级一等奖/特等奖。2001年获国务院政府特殊津贴，2007年获国家杰出青年科学基金。2008年被评为全国化工优秀科技工作者， 2016年被评为全国优秀科技工作者，2017年当选中国科学院院士，2020年获全国创新争先奖。

研究领域包括1. 生物智能响应材料：生物医学荧光探针，肿瘤光、热、超声治疗增敏剂，核酸药物递送纳米材料等；2. 半导体及显示用材料：先进光刻材料、芯片有机材料、彩色光刻胶、CMOS彩色滤光染料等；3. 功能高分子材料：特种聚合物结构与性能、复合材料界面反应助剂、光电磁热响应材料等；4. 分子材料人工智能：功能分子机器学习、元学习、功能分子预测与筛选等。

https://www.x-mol.com/university/faculty/385543 

陈小强教授

深圳大学特聘教授，博士生导师，国家自然科学基金优青获得者，国际学术期刊Sensors and Actuators B副主编。江苏省杰出青年基金获得者、江苏省“六大人才高峰”高层次人才（B类）、江苏省“青蓝工程”中青年学术带头人、江苏省“333工程”培养对象。研究方向涉及有机/超分子光化学、化学与生物传感器、智能递送材料等领域。主持国家自然科学基金优青、面上、科技部重点研发计划课题等项目。以一作或通讯作者发表SCI论文130余篇，包括Nature Protocols、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、AIChE Journal、Biomaterials、Biosensors and Bioelectronics、ACS Appl. Mater. Inter.、Ind. Eng. Chem. Res.等。论文被他人引用13000余次，H指数52，以第一发明人获授权发明专利10项，近五年（2018-2022）连续入选Elsevier“中国高被引学者”榜单。