精氨酸突变：高效加速蛋白质间硫氟交换与磷氟交换反应

在蛋白质中引入硫氟交换（SuFEx）和磷氟交换（PFEx）化学反应，极大地推动了这些强效点击化学在生物环境中的研究与应用。这些具有生物特异性的化学反应能够在蛋白质之间以及蛋白质与其他生物大分子（如RNA或糖）之间精确构建共价连接。在生物大分子间引入这种强大、稳定且不可逆共价连接，能够改变蛋白质的特性、揭示先前难以研究的生物分子间相互作用，并促进强效共价蛋白质疗法的发展。这些应用的有效性很大程度上依赖于共价反应速率。然而目前蛋白质之间的SuFEx和PFEx反应效率仍不理想。使用催化剂能加速小分子中的SuFEx和PFEx反应，但其在蛋白质环境中的作用尚未得到研究，并且大多数催化剂与生物大分子并不兼容。因此，迫切需要一种普遍且生物相容的方法来增强蛋白质之间的SuFEx和PFEx反应速率。

近日，加州大学旧金山分校的Lei Wang（点击查看介绍）课题组在Angewandte Chemie International Edition 上发表研究论文，发现在生物潜活氨基酸（Latent Bioreactive Uaa）附近策略性地引入精氨酸（Arg）突变，可以显著加速蛋白质界面上的SuFEx和PFEx反应速率。该文章第一作者为博士后曹丽和博士后于炳辰（现为佐治亚州立大学助理教授）。

图1. Arg 突变策略提高SuFEx 和PFEx反应速率示意图。

Lei Wang教授在2013年率先提出了“临近触发反应”（proximity-enabled bioreactivity）的概念，通过扩展密码子技术实现了在蛋白质中引入生物潜活氨基酸，这些氨基酸通过临近触发反应的机理与邻近的目标生物基团发生反应，从而在蛋白质内部、蛋白质之间、或蛋白质与其他生物大分子间形成精准共价连接(Chem. Rev. 2024, 124, 8516)。基于这种策略，课题组成功地开发出靶向PD-L1的共价小蛋白用于癌症免疫治疗、共价纳米抗体用于中和新冠病毒以及共价放射性核素蛋白用于靶向核素疗法等。在这篇文章里，该课题组开发出了一种通用且生物兼容的加速蛋白质中的SuFEx和PFEx反应速率的新方法，并应用于首个共价NK细胞结合剂（NK cell engager）。

作者首先研究了在小分子 SuFEx 反应中具有催化作用的水溶性路易斯碱四甲基胍 (TMG) 是否也能在蛋白质-蛋白质界面上催化 SuFEx 反应。结果发现，在Afb-Z 蛋白对中，TMG 对 FSY 与目标氨基酸 Tyr、His 或 Lys 之间的 SuFEx 反应并未表现出催化效果。接下来，作者开始探索是否可以通过在 SuFEx 反应位点附近引入蛋白质突变来产生催化效应。鉴于精氨酸 (Arg) 的胍基侧链最有希望模拟 TMG 或其他含氮路易斯碱的功能，作者将 Arg 引入含有 FSY 的蛋白质中，而不是引入靶蛋白中。由于靶蛋白通常难以在体内进行遗传或化学修饰，这种策略能够有效避免对靶蛋白本身进行突变，这对于共价蛋白在体内的应用尤为重要。接下来，根据蛋白质晶体结构，作者分别在靶向HER2受体的纳米抗体2rs15d、靶向EGFR受体的纳米抗体7D12以及Affibody中插入非天然氨基酸FSY，并在合适位置中引入Arg单点突变。结果发现，Arg的引入能够显著提高FSY 与靶残基的反应速率，这种加速方法广泛适用于所有靶残基和不同的蛋白质系统，结合亲和力范围从微摩尔级到纳摩尔级，且该加速效果在体外和细胞表面上均有效。

图2. Arg 突变的引入加速了蛋白质间的 SuFEx 反应速率。

该课题组在过去报道过多种具有SuFEx反应活性的生物潜活氨基酸，例如mFSY、FFY等等。作者发现将Arg突变引入到带有mFSY蛋白质中也能够显著提高其与靶蛋白之间的反应速率。对于相较于已显著提高SuFEx反应速率的生物潜活氨基酸FFY，Arg突变表现出更优越的加速能力。PFY是课题组最近开发出的利用前沿点击化学PFEx反应的生物潜活氨基酸，作者在Afb蛋白中插入PFY并引入Arg突变，发现Afb-Z蛋白之间形成共价键的速率同样得到显著提高。

图3. Arg 突变的引入加速了蛋白质间的 PFEx 反应速率。

SuFEx 化学的一个前沿研究领域是开发用于癌症治疗的共价蛋白质疗法。然而，在肿瘤组织微环境中pH普遍呈现弱酸性，而SuFEx 反应在酸性条件下反应速率会降低，这给利用SuFEx 反应开发共价蛋白质药物带来了极大的挑战。令人惊喜的是，作者发现，Arg 突变能够显著提高在 pH 6.5 和 6.0 条件下蛋白质中 SuFEx 反应的速率，这一增强效果对酸性环境中的共价蛋白质靶向策略和治疗方法的开发提供了新的思路。

图4. Arg 突变的引入加速了在酸性 pH 条件下 FSY 的 SuFEx 反应速率。

最后，作者利用Arg加速策略开发出了首个共价NK细胞结合剂（covalent NK cell engager）。该共价NK细胞结合剂由特异性靶向 CD16 的纳米抗体 C21 和特异性靶向 EGFR 的纳米抗体 7D12 两部分构成。在7D12的Tyr109位点引入了生物潜活氨基酸 FSY，以促进其与肿瘤细胞上的 EGFR 的共价结合。此外，还在 7D12蛋白的Glu44 处引入了 Arg 突变，以提高其与靶蛋白的交联效率。这款具有共价结合能力的NK细胞结合剂在采用Arg加速策略后，其NK细胞的激活能力得到了显著提高。

图5. Arg 突变的引入提高了共价NK细胞结合剂的NK细胞激活能力。

综上所述，Lei Wang课题组开发出了一种新方法，通过在生物潜活氨基酸附近策略性地引入Arg突变，从而加速蛋白质中SuFEx和PFEx的反应效率。这种方法具有广泛有效性，能够显著提高反应速率和最终产率，并确保了即使在不利的酸性条件下，SuFEx反应也能高效进行。该方法不仅为SuFEx和PFEx化学反应提供了机制性见解，还为在生物研究和生物治疗应用中有效利用这些强大的化学反应提供了一种实用且生物相容的策略，这一进展有望显著推动相关领域的发展。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Arginine Accelerates Sulfur Fluoride Exchange and Phosphorus Fluoride Exchange Reactions between Proteins

Li Cao, Bingchen Yu, Paul Klauser, Pan Zhang, Shanshan Li, Lei Wang

Angew. Chem. Int. Ed., 2024, DOI: 10.1002/anie.202412843

导师介绍

Lei Wang课题组

https://www.x-mol.com/groups/Wang_Lei_UCSF