JACS：新型可放大系统用于定量分析活细胞中的过氧化氢

在生命系统中，尽管许多氧化还原信号分子的浓度很低，通常范围从微摩尔到亚微摩尔水平，但依然在许多生物学途径和疾病机制中发挥重要作用。然而，由于现有检测方法缺乏必要的灵敏度和定量能力，在活细胞中准确检测低丰度分析物一直是一个重大挑战。

近日，美国贝勒医学院Jin Wang教授（点击查看介绍）课题组在J. Am. Chem. Soc.上发表论文，报道了一种新的化学诱导放大系统，用于活细胞中低丰度氧化还原信号分子的定量。他们利用H₂O₂作为概念验证分析物，并开发了一种探针通过结合NanoBiT系统和雄激素受体二聚化作为报告机制来检测细胞过氧化物水平。该系统对内源性和外源性诱导的细胞过氧化物水平变化表现出高度敏感的响应。更值得一提的是，该系统也可以适用于其他信号分子的定量研究。

2015年，Jin Wang教授课题组曾报道了首个利用可逆反应测定活细胞中谷胱甘肽浓度的工作。一开始，该课题组希望将这个可逆反应的概念应用于其他低浓度代谢物检测，如半胱氨酸和硫化氢（H₂S），但他们意识到找到具有适当K_d和动力学的反应并非易事。在设计探针时，该课题组有三个标准：（i）使用的探针浓度应低于分析物浓度的1%，以最大限度地减少对生物系统的干扰；（ii）探针应能在活细胞中定量测量分析物浓度；（iii）检测时间应在方便的实验时间范围内，理想情况下为1-2小时。但如果要在细胞中测量1 µM的分析物，要使用约10 nM的荧光探针，这对于常规共焦显微镜来说浓度太低。因此，即使能找到具有适当K_d和动力学的反应，由于仪器灵敏度的限制，也不太可能成功。这就意味着必须要找到一种放大信号的方法。该课题组于是放弃了前述的可逆反应概念，开始思考如何在与分析物反应时产生"催化剂"以放大信号。

从本质上来看，一些激素就是该课题组正在寻找的小分子“催化剂”。他们发现雄激素受体（AR）系统背景较低，可能是个好选择。于是，该课题组用H₂O₂响应基团封闭雄激素DHT以提高反应速率。再结合Promega的 nanoLuc/NanoBiT 系统，化学诱导二聚化基可放大探针（Chemically Induced Dimerization-based Amplifiable Probe, CIDAP）系统被设计了出来。下一个问题是如何进行分析物的定量。该课题组借用了剂量-反应偏移的概念。由于探针浓度远低于分析物浓度，探针的消耗应遵循准一级反应。这意味着无论使用什么探针浓度，单位时间内探针消耗的百分比是恒定的。基于剂量-反应偏移概念，该课题组设计了实验，通过滴定探针和DHT浓度来计算基于EC₅₀变化的探针消耗百分比。

与之前的基于小分子的H₂O₂探针相比，本文的探针能够检测活细胞中内源H₂O₂的水平。该工作为活细胞中低浓度分析物的定量提供了一个新的策略，同样的概念可以轻松扩展到NO、H₂S和其他代谢物。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Development of a Novel Amplifiable System to Quantify Hydrogen Peroxide in Living Cells

Lingfei Wang, Hanfeng Lin, Bin Yang, Xiqian Jiang, Jianwei Chen, Sandipan Roy Chowdhury, Ninghui Cheng, Paul A. Nakata, David M. Lonard, Meng. C. Wang, Jin Wang*

J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c05366

导师介绍

Jin Wang

https://www.x-mol.com/university/faculty/257817