天大董敏组JACS：土壤细菌通过自由基酶构筑C-As键

胂丝菌素（arsinothricin，AST）是由土壤细菌产生的一种具有广谱抗菌活性的含砷抗生素。胂丝菌素生物合成的关键步骤C-As键构筑被预测是由ArsL蛋白催化。ArsL具有保守的CxxxCxxC结构域，被归类为SAM自由基酶，然而ArsL的反应活性和机制未知。近日，天津大学董敏（点击查看介绍）课题组在《美国化学会志》（J. Am. Chem. Soc.）在线发表了研究论文，发现ArsL催化非经典的SAM切割反应，通过产生ACP自由基，与底物亚砷酸反应产生AST-OH，进而在甲基转移酶ArsM作用下最终产生胂丝菌素。他们还发现ArsL C端结构域RCCLKC对底物识别有重要作用。ArsL蛋白是迄今发现的首个具有经典的SAM自由基酶CxxxCxxC结构域，但不产生5´-脱氧腺苷自由基，而通过切割SAM产生ACP自由基的SAM自由基酶。该发现预示SAM自由基酶家族可能有更多类似酶存在。

图1. 胂丝菌素可能的生物合成途径。

砷是广泛分布于自然界的有毒准金属元素，主要以无机砷的形式存在。细菌可将无机砷转化为有机化合物由此降低毒性，如甲基砷酸等。胂丝菌素是在土壤细菌Burkholderia gladioli GSRB05代谢物中发现的一种含砷有机物，其结构与谷氨酸类似，因此可作为谷氨酰胺合成酶抑制剂，具有抗菌抗病毒活性。其生物合成涉及两个蛋白ArsL和ArsM。推测ArsL催化第一步反应，切割辅因子SAM产生ACP，并与底物亚砷酸反应催化C-As键的形成，产生AST-OH；甲基转移酶ArsM催化第二步反应，负责AST-OH甲基化形成AST，如图2。

图2.（A）推测胂丝菌素生物合成途径。（B）经典SAM自由基酶和非经典SAM自由基酶Dph2催化的SAM切割反应 

ArsL含有保守的CxxxCxxC结构域，因此被预测为SAM自由基酶家族成员。SAM自由基酶通过CxxxCxxC结构域与[4Fe-4S]簇结合。还原的[4Fe-4S]⁺簇切割SAM生成5´-脱氧腺苷（5'-dA）自由基，进而攫取底物氢原子产生底物自由基催化下游反应。目前只有白喉酰胺生物合成中的非典型SAM自由基酶（不含保守CxxxCxxC结构域）Dph2通过自由基机制切割SAM产生ACP自由基，修饰底物蛋白EF2（图2）。此外，许多酶通过亲核机制裂解SAM催化ACP转移反应。

图3. ArsL的SAM裂解反应。（A）还原的ArsL切割SAM产生MTA。（B）总反应中分离的MTA质谱。

本文作者通过一系列体外实验证实ArsL蛋白能通过自由基机制催化非经典SAM切割反应。ArsL蛋白在还原剂连二亚硫酸钠（DT）参与下能切割SAM的 C_γ,Met-S键产生MTA。在HPLC-HRMS直接检测及衍生化反应条件下均检测到L-高半胱氨酸亚磺酸（DT淬灭ACP自由基产物）（图3, 图4）。在柠檬酸钛（III）作为还原剂时检测到2-氨基丁酸产生。证明ArsL蛋白能催化非经典SAM切割反应。

图4. DT淬灭的ACP自由基产物HSA的检测。（A）LC-MS检测反应中HSA。（B）HSA质谱数据（13.3 min）。（C）HPLC检测反应DNFB衍生化。（D）HSA衍生化质谱。

在底物亚砷酸存在的反应中，不同还原剂催化的反应有显著差异。其中，DT作为还原剂时，虽然切割SAM产生MTA量最多，但是衍生化反应发现产物AST-OH量最低。这是因为DT与底物结构相似，和底物之间存在竞争关系。MV/NADPH以及柠檬酸钛做还原剂都有大量产物AST-OH产生（图5）。在ArsL与ArsM的串联反应中检测到了终产物AST（图6）。

图5. ArsL产物检测（A）不同还原剂催化的切割SAM反应。（B）HPLC检测不同还原剂催化的反应产物（L-FDAA衍生化）（C）HR-MS鉴定产物。（D）LC-MS检测反应中产物AST-OH。（E）AST-OH质谱数据（17.4 min）。 

图6. ArsL和ArsM串联产物检测（A）不同时间串联反应的SAM切割活性。（B）HPLC检测不同时间串联反应产物（L-FDAA衍生化）（C）产物衍生化质谱数据。（D）LC-MS检测反应中产物AST。（E）AST质谱（19.3 min）。 

为进一步研究该类酶的特性，作者进行blast序列分析，发现ArsL C端保守序列RCCLKC，通过序列截短和半胱氨酸突变证明了此段序列对底物识别的重要性。NCBI数据库中含有RCCLKC-tail SAM自由基酶家族 (NCBI HMM accession NF040542.1)，作者推测该家族成员均能催化非经典SAM切割反应。

图7. 推测的ArsL反应机制

综上，实验证明了SAM自由基酶ArsL能催化非经典SAM切割反应产生ACP自由基，并通过ArsM串联，体外重构了AST生物合成（图7）。ArsL蛋白是目前发现唯一的含有保守基序CxxxCxxC，并通过自由基机制催化非经典SAM切割反应的SAM自由基酶，预示着该家族可能有更多类似酶通过产生ACP自由基催化反应。

天津大学硕士研究生姚亚娣和何家乐为论文的共同第一作者，天津大学董敏教授为论文的通讯作者。天津大学博士研究生陈帆也参与了部分研究工作。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Arsinothricin Biosynthesis Involving a Radical SAM Enzyme for Noncanonical SAM Cleavage and C–As Bond Formation

Yadi Yao, Jiale He, Fan Chen, Min Dong*

J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c06403

导师介绍

董敏

https://www.x-mol.com/university/faculty/64301